多能性細胞DE NOVOを生成します 

関連出願の相互参照 

[0001]本出願は、米国仮出願番号第35 USC§119（e）の下で利益を得る。61/637631 2012年4月24日およ ​​び61/779533出願された3月13日提出された^第にその内容をここに援用する、2013年には、その全体。

技術分野 

【0002】本明細書に記載の技術は、多能性細胞の製造に関する。 

バックグラウンド 

。Hockemeyer、D.;【0003】多能性細胞を得るための現在の方法は、主に限られた可用性の組織（例えば胚組織または臍帯血）、または初期化因子（ハンナ、J.ら、Cell 2008 133、250から264の追加に依存していますら、Cell幹細胞2008 3、346から353;キム、D.ら、Cell幹細胞2009 4、472-476;キム、JB自然2009 461、649から643;岡部、M.らブラッド2009。外因性核酸の導入を含む114、1764から1767年）。容易に幹細胞を産生する方法、特に、自己幹細胞は、外因性再プログラミング因子の添加によって導入合併症なしに、細胞分化の研究および幹細胞ベースの治療法の開発を加速するであろう。このような火傷、化学的損傷、外傷や放射線などの刺激物への暴露の結果としての細胞に対する損傷が、癌細胞になるように、正常な体細胞を変化させることができる、健康な成人の体細胞を変換することができるという直接的な証拠が存在しないと仮定されているが初期化因子の特定の操作をすることなく、他の状態に。

【0004】これまで、研究者らは、成体組織に「成体幹細胞」を見つけることを報告しています

（レイノルズ、BA＆ワイス、S.科学1992 255、1707年から1710年;。Megeney、LAら、ジーンズ・アンド・ディベロップメント1996年10、1173から1183;整形外科研究1991年9のキャプラン、AIジャーナル、641-650; Lavker、 RM＆日、捜査皮膚科のTTザ・ジャーナル1983年81、121S-127S）。このようなレポートは、論争のまま。例えば、幹細胞マーカーのOct4を発現する細胞を探している研究者は、通常の恒常性における成人の骨髄中のOct4発現細胞を見つけることができなかった、（Lengner、CJら細胞周期2008年7、725から728;ベルク、JS＆グッデル、 MA細胞幹細胞2007 1、359から360）、他は異なる成体組織（江、Y.らからのOct4発現細胞を単離する能力を報告しながら、自然2010 418、41-49; D'Ippolito、G.らアル細胞科学2004 117、2971年から2981年のジャーナル;ジョンソン、J.ら、Cell 2005 122、303から315;。Kucia、M.ら白血病2006 20、857から869;黒田、Y.ら。 PNAS 2011 107、8639-8643;小保方、H.ら組織工学2011パートA 17、607から615;。。Rahnemai-アザー、A.らCytotherapy 2011 13、179-192;黄、Y.ら。移植2010年89、677から685;。Zuba-スルマ川、EKら細胞および分子医学誌2011年15、1319年から1328年;移植2011年16、59から​​71のPaczkowska、E.ら史料）。これらの細胞は、成体幹細胞の集団のいずれかを表すか、単に使用されている技術のアーチファクトであると仮定されています。いずれの場合も、それらはまれに残り、研究および治療目的のための多能性細胞の適切な供給源を表すものではありません。

概要 

【0005】本明細書に記載さは、例えば、分化した、大人の細胞から、多能性細胞のde novoを生成または製造する方法です。本明細書に記載の方法はさらに、（細胞の成熟を低下させるか、など）、細胞の多能性を増加させることに関連することができ、例えば、多能細胞が多能性になることを引き起こします。多能性細胞の産生に関連する本明細書に記載の技術の態様は、環境ストレスは、より多能性の表現型をとるように細胞を誘導することができることを本発明者らの認識に基づいています。

【0006】本明細書に記載の一態様では、ストレスに細胞を付すことからなる、多能性細胞を生成する方法です。いくつかの実施形態において、方法はさらに、多能性を示す細胞を選択することを含むことができます。いくつかの実施形態では、細胞、組織の一部として存在していません。いくつかの実施形態では、ストレスは、細胞から細胞質の少なくとも約40％を除去することを含みます。いくつかの実施形態では、ストレスは、細胞からのミトコンドリアの少なくとも約40％を除去することを含みます。いくつかの実施形態では、ストレスはストレスに暴露された細胞の少なくとも10％の細胞膜を破壊するのに十分です。いくつかの実施形態において、細胞は体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞です。いくつかの実施形態において、細胞は、単離された細胞です。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞の異種集団中に存在します。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞の均一な集団で存在します。いくつかの実施形態では、多能性を示す細胞を選択するのOct4またはNanogの、もしくはOct4およびNanogの発現を発現する細胞を選択することを含みます。いくつかの実施形態では、多能性を示す細胞を選択することが付着されない細胞を選択することを含みます。

[0007]いくつかの実施形態では、細胞質の少なくとも約50％が細胞から除去されます。いくつかの実施形態では、細胞質の少なくとも約60％が細胞から除去されます。いくつかの実施形態では、細胞質の60〜80％の間に細胞から除去されます。いくつかの実施形態では、細胞質の少なくとも約80％が細胞から除去されます。いくつかの実施形態では、細胞質の少なくとも約90％が細胞から除去されます。

外傷、機械的刺激、化学的暴露、超音波刺激、酸素欠乏、放射線、及び極端な温度への暴露：【0008】いくつかの実施形態では、ストレスから選ばれた少なくとも1環境刺激に対する細胞の暴露を含みます。いくつかの実施形態では、応力は、約6.0〜約4.5のpHに細胞をさらすことを含みます。いくつかの実施形態では、応力は、約5.8、約5.4からのpHに細胞をさらすことを含みます。いくつかの実施形態において、細胞は、1日以下のために露出されています。いくつかの実施形態において、細胞は、1時間以内のために露出されています。いくつかの実施形態において、細胞は、約30分間露出されます。

【0009】いくつかの実施形態では、極端な温度への曝露は、C 35°C以下または42℃以上の温度に細胞を曝露することを含みます。いくつかの実施形態では、極端な温度への曝露は、、または少なくとも約85℃の温度に、細胞の凍結または暴露以下の温度に細胞をさらすことを含みます。いくつかの実施形態では、機械的刺激は、細胞のサイズよりも小さい開口部を有する少なくとも1つのデバイスを介して細胞を通過含みます。いくつかの実施形態では、機械的刺激が徐々に小さく開口を有する複数のデバイスを介してセルを通過含みます。

【0010】いくつかの実施形態では、細胞質の部分の除去は、細胞質からミトコンドリアの少なくとも約50％を削除します。いくつかの実施形態では、細胞質またはミトコンドリアの除去は、細胞質からミトコンドリアの約50％〜90％を除去します。いくつかの実施形態では、細胞質またはミトコンドリアの除去は、細胞質からミトコンドリアの90％以上を除去します。

[0011]いくつかの実施形態では、方法はさらに、多能性細胞の増殖を可能にするために、多能性細胞を培養することを含むことができます。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、Oct4およびNanogのからなる群から選択される1つまたは複数の多能性幹細胞マーカーを発現します。

[0012]いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞です。いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞です。いくつかの実施形態において、細胞は、成体細胞または新生児の細胞です。いくつかの実施形態において、方法はさらに、in vitroで多能性細胞を維持することを含むことができます。いくつかの実施形態では、細胞のエピジェネティックな状態をより厳密に胚性幹細胞のエピジェネティックな状態に類似するように変更されます。いくつかの実施形態では、エピジェネティックな状態は、メチル化パターンを含みます。

【0013】本明細書に記載の一態様では、候補薬剤と、本明細書に記載の方法により製造多能性細胞を接触させることを含むアッセイです。いくつかの実施形態において、アッセイは、生存率の一つ以上に影響を与える薬剤を同定するために使用することができ、

分化、多能性細胞の増殖。【0014】本明細書に記載の一態様では、被験体のための細胞治療の方法本明細書に記載の方法により製造した多能性細胞の使用です。

【0015】本明細書に記載の一態様では、細胞は、対象から得られる本明細書に記載の方法に従って細胞から多能性細胞を生成含む、細胞療法を必要とする対象における自己細胞治療方法であり、かつ多能性細胞または被験体へのそれらの分化した子孫細胞を含む組成物を投与します。いくつかの実施形態において、方法はさらに、前に被験体に組成物を投与する事前定義された細胞系統に沿って分化多能性細胞を分化含むことができます。

[0016]本明細書に記載の一態様では、多能性細胞は、本明細書に記載の方法によって細胞から生成され、多能性細胞を含む組成物です。 

本明細書に記載の[0017]一態様では、多能性細胞の自己再生能力を増加させる方法、の存在下で細胞を培養することを含む方法であります 

副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）または3I媒体。いくつかの実施形態において、細胞は、ACTHを含むLIF培地で培養します。いくつかの実施形態では、ACTHは、約100μΜ約0.1μΜからの濃度で存在します。いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書に記載の方法により生成された細胞です。いくつかの実施形態では、細胞は全能性細胞です。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも3日間、ACTHまたは3I培地の存在下で培養されます。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも5日間、ACTHまたは3I培地の存在下で培養されます。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも7日間、ACTHまたは3I培地の存在下で培養されます。いくつかの実施形態では、培養工程の後に、細胞は、のOct3 / 4からなる群から選択される幹細胞マーカーの検出可能なレベルを表します。Nanog; Rexl; KLF; Sox2の; KLF2; Esrr-β; TBX3; そして、KLF5。

[0018]いくつかの態様において、本明細書に記載される方法において使用される細胞は、インビボです。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される細胞はインビトロです。

図面の簡単な説明 

【0019】図1A-1Dは、Oct4のは、CD45陽性の体細胞から細胞の生成を表現描写図。図1Aは、ストレス処理した細胞のあるOct4-GFP発現を示します。未処理のコントロールはしなかったが、ストレス処理した細胞は、Oct4の-GFPを発現します。Oct4の発現コロニーの倍率はストレス処置群において右上に示されています。スケールバーは100μιηを示しています。図1Bは、ストレス処理細胞および非ストレス処理したコントロールの集団分析を示します。細胞集団を発現するGFPを5日目、図1Cにのみ応力処置群において観察された日にストレス処理の前と後のCD 45陽性細胞の細胞サイズの分析を示す。7.図1Dは、後のCD45陽性細胞の経時変化を示しますストレス処理。【0020】動物カルス細胞（ACCS）の2A-2Bの描写特性評価を図。図2Aは、多能性マーカー遺伝子の経時的遺伝子発現の変化を示しています。メッセンジャーRNAレベルは、GAPDHに対して正規化しました。（N = 3、平均+ SD）図2Bは、Oct4およびNanogのプロモーター遺伝子のメチル化分析を示します。

【0021】図3A-3Dは、ストレス処理後の細胞の変形を示している図。図3Aは、ACCS生成フェーズ中にストレス防御遺伝子の相対的遺伝子発現を示します。サンプルは3日目と7日目に採取し、CD45陽性細胞と比較しました。（N = 3、平均+ SD）図3Bは、全細胞ATPの測定値を示します。（N = 3、平均+ SD）図3Cは、ROSの測定を示しています。エラーバーはSDを示します。図3Dは、ミトコンドリアDNAの複製因子の相対的遺伝子発現を示します。（N = 3、平均+ SD）

【0022】ACCSから4A-4B描いキメラマウスの生成を図。図4Aは、キメラマウスの生成のスキームを示します。パネル（i）は、ACSは、ACSが、その後胚盤胞に注入小片に切断したトリプシンまたは（パネルII）で単一細胞に解離させたことを示しています。図4Bは、キメラ貢献度分析を示しています。9仔から組織をFACSによって分析しました。

【0023】ACC-発生条件と5A-5Cの実験を図。図5Aは、CD45陽性細胞は、様々なストレスにさらされたとのOct4-GFP発現をFACSにより分析したことを示しています。ストレス処理後に生存細胞内で発現細胞のOct4-GFPの割合。（N = 3、平均+ SD）、図5（b）は、pH条件の決意を示しています。CD45陽性細胞を、異なるpHの溶液に曝露しました。ストレス処理後の3日目、のOct4-GFP発現をFACSにより分析しました。図5Cは、培養条件の決意を示しています。ストレス処理した細胞は、様々な媒体中で培養しました。GFP発現ACSは14日目に計数した数（N = 3、平均+ SD）

【0024】図6A-6Bは由来CD45陽性細胞からACCSの生成を示している図

ICRマウス。図6Aは、ストレス処理後のCD45陽性細胞の経時的変化を示しています。E-カドヘリンおよびSSEA-1の発現をFACSにより分析しました。図6Bは、E-カドヘリン/ SSEA1のOct4の遺伝子発現は、二重陽性細胞は、RT-PCRにより確認されたことを示しています。（N = 3、平均+ SD）

【0025】図7A-7BはGOFマウス由来の様々な組織からACC世代を描く図。図7Aは、ストレス処理後の細胞を発現のOct4-GFPの割合を示しています。体細胞は、種々の組織から単離され、そして種々のストレスにさらされました。OCT4-GFP発現をFACSにより分析しました。図7Bは、種々の組織に由来するACCSの胚の遺伝子発現を示します。遺伝子発現は、GAPDHで正規化しました。（N = 3、平均+ SD）[0026]図8は、第1の間のストレス防御遺伝子の相対的な遺伝子発現を示します

7日。ストレス処理の後、細胞を1日目、3及び7で回収し、遺伝子発現は、ネイティブCD45陽性細胞と比較しました。青いグラフは、熱ショックタンパク質の遺伝子発現を示します。緑のグラフは、DNA修復遺伝子の発現を示しています。レッドグラフは、酸化還元遺伝子の遺伝子発現を示しています。Y軸は、発現の相対折り目を示しています。

【0027】図9は、ACCSの分化を示しています。グラフは、キメラ貢献度分析を示しています。種々の体細胞に由来するACCSで生成キメラ胎児をFACSによって分析しました。グラフは15.5にE13.5で5キメラ胎児の平均値を示しています。

【0028】図10は、ストレス処理は、間葉上皮移行（MET）を介​​して体細胞に再プログラム化を引き起こしたことを示しています。の発現

MET関連遺伝子は、天然の細胞中に示され、そして細胞のストレス処理後3および7日目に開始しました。y軸は、その遺伝子の発現レベルを有するサンプル中のレベルに対して正規化％の発現を示しています。

【0029】図11は、ストレスの前と後の細胞集団のFACS分析を示します。

GFP発現は、試験した各組織タイプからポストストレス細胞集団において、多能性細胞の生成を示し、明らかでした。 

【0030】図12A-12Eは、コミット体細胞に運命変換を誘発し、低pH処理を実証する図。図12Aは、概略的な実験プロトコルを示しています。図12Bは、フローサイトメトリー分析を示している（トップ行：OCT3 / 4：4：GFの^{P +} / CD4 ^{5 "} ;下段：非処置CD4 ⁵⁺細胞）。y軸はのOct3 / 4の番号です：GFP細胞、およびX軸は、CD45 +細胞の数で両軸が0、100、1000年、10,000の主要な単位にマークされている。図12Cは、生存OCT3 / 4のグラフを示す：。：GFP ⁺およびOCT3 / 4：GFP-細胞を超えます。。図12DはのOct3 / 4 :: GFP +細胞（左のピーク）とCD45 +細胞（右ピーク）のセルサイズのグラフを示す培養時間は、図12Eは、単離されたOCT3 / 4でtcrfiのゲノム再編成の分析の結果を示します。 ：GFP ⁺ゲノムPCRによる球。

【0031】図13A-13Bは、低pHに誘発されることを示している図のOct3 / 4 ⁺細胞が多能性を持っています。図13Aは、定量PCRによる遺伝子発現解析のグラフでを示します

低pH誘発のOCT3 / 4：4：GFPは⁺ D7上の細胞のCD45と比べて⁺細胞（シリーズは左から右へ、OCT3 / 4、NANOG、SOX2、ecatl、esgl、daxlおよびKLF4式から、表します）。サンプルは3日目と7日目に採取し、CD45陽性細胞と比較しました。（N = 3、SD平均+）図13Bは、亜硫酸水素塩配列決定の結果を示すがOCT3 / 4およびNanogプロモーター領域でした。CD45 ⁺細胞は、または追加の文化なしに、両プロモーターで頻繁にメチル化パターンを示しました。【0032】図14A-14Bは、STAP細胞が他の組織供給源から得ることができることを示している図。図14Aは、OCT3 / 4の生成速度のグラフを示す：GFP ^+は左から右に、CD45 +細胞、骨髄、脳、肺、筋肉の組織の数（一連表し、脂肪ためD7培養における細胞、線維芽細胞、肝臓、および軟骨細胞）。図14Bは、OCT3 / 4における遺伝子発現解析のグラフを示している：：GFP ⁺細胞クラスター（シリーズは、左から右に、表す、のOct3 / 4、Nanogの、Sox2の、KLF、およびRexl O式）。

【0033】図15A-15Bは、多能性細胞としてSTAP細胞の特性を示している図。

図15Aは、（シリーズ表し、右から、ES、EpiSC、STAP、及びCD45左）STAP細胞におけるES細胞マーカーの遺伝子発現のグラフを示します。図15Bは、STAP細胞のX染色体不活性化の％のグラフを示します。

【0034】図16Aは、にFACSによって分析したOct4-GFP発現のグラフを示します

CD45陽性細胞は、様々なストレスにさらさ。ストレス処理後に生存細胞内で発現細胞のOct4-GFPの割合。（N = 3、平均+ SD）図16Bは、pH条件の決意のグラフを示します。CD45陽性細胞を、異なるpHの溶液に曝露しました。ストレス処理後の3日目、のOct4-GFP発現をFACSにより分析しました。（N = 3、平均値+ SD）。図16Cは、培養条件の決意のグラフを示します。ストレス処理した細胞は、様々な媒体中で培養しました。GFP発現ストレス改変細胞塊の数は14日目に計数した（N = 3、平均+ SD）

【0035】図17A-17BはICRマウス由来のCD45陽性細胞からのSACの生成を示している図。図17Aは、ストレス処理後のCD45陽性細胞の経時変化を示しています。E-カドヘリンおよびSSEA-1の発現をFACSにより分析しました。図17Bは、RT-PCRにより確認E-カドヘリン/ SSEA1二重陽性細胞のOct4遺伝子発現のグラフを示します。（N = 3、平均+ SD）

【0036】図18A-18Bは由来の様々な組織からのSACの生成を示している図

GOFマウス。図18Aは、ストレス処理後の細胞を発現のOct4-GFPの比のグラフを示します。体細胞は、種々の組織から単離され、そして種々のストレスにさらされました。OCT4-GFP発現をFACSにより分析しました。シリーズは、左から右へ、BM、脳、肺、筋肉、脂肪、線維芽細胞、および肝臓から、表します。図18Bは、種々の組織由来のSACの胚の遺伝子発現のグラフを示します。遺伝子発現は、GAPDHで正規化しました。（N = 3、平均+ SD）シリーズは、左から右へ、のOct4、Nanogの、Sox2の、Klf4及びEcatlから、表します。

【0037】図19は、最初の7日間のストレス防御遺伝子の相対的な遺伝子発現のグラフを示します。ストレス処理の後、細胞を1日目、3及び7で回収し、遺伝子発現は、ネイティブCD45陽性細胞と比較しました。Y軸は、発現の相対折り目を示しています。

【0038】図20は、TCR鎖の再配列は、SACのとCD45 +細胞からのSAC由来キメラマウスの解析描いています。2Nキメラマウス＃1、＃2、＃3、＃5、＃6、＃7、＃8、＃9は、再配置された複数のDNAを表明しました。

【0039】図21は、4Nキメラマウスのジェノタイピング分析を示します。ジェノタイピングは、129 / SV由来のSACで発生した4Nキメラマウスを証明するために行われた^X ICR由来B6GFP F1および4N胚盤胞をSACの（129 / SV> <B6GFP）特定の遺伝子を発現しました。

[0040]図22は、STAP細胞がin vivoでの胚と胎盤組織の両方に寄与することを示しています。グラフは、胚の部分にも胎盤に貢献し、嚢組織卵黄細胞を注射された胎児の比率を示しています。

【0041】図23A-23Cは、FGF4治療はいくつかを誘発することを示している図 

STAP細胞における栄養膜系譜文字。図23のAは、の概略図を示しています

STAP細胞からTS-様（F4I）細胞を誘導するFGF4処理。図23Bは、マーカー発現の定量PCR分析のグラフを示します。図23のCは、FACS分析による胎盤の貢献の定量化のグラフを示します。F4I細胞とは異なり、ES細胞は、検出可能なレベルで胎盤組織に寄与しませんでした。

【0042】図24A-24Dは、ES細胞様幹細胞が由来することができることを示している図

STAP細胞。図24Aは、STAP細胞から幹細胞株の誘導の概略図を示します。図24Bは、120日間の維持培養におけるSTAP-S細胞の力強い成長を示すグラフを示しています。同様の結果は、16の独立した系統で得られました。これとは対照的に、親STAP細胞が急速に数が減少しました。図24Cは、マーカー遺伝子発現の定量PCR分析のグラフを示します。ESとSTAP-S細胞は、CD45で発現されなかった多能性関連遺伝子発現⁺細胞。図24Dは、重硫酸塩配列決定によるDNAメチル化研究の概略を示します。

[0043]図25A-25Bは、そのSTAP幹細胞を実証する図は、多能性と生殖系列伝達と四倍体相補性と互換性があります。図25のAは、胚盤胞注入アッセイ（2N）でキメラマウスの様々な組織にSTAPS細胞の寄与のグラフを示します。図25Bは、胎盤組織への貢献のグラフを示します。親STAP細胞とTS細胞とは異なり、STAPS細胞はもはや胎盤の貢献のための能力を保持していません。三つの独立した系統を試験し、すべてのは、胚の部分に多大な貢献を示しました。詳細な説明

本明細書に記載された技術の[0044]態様は、細胞からの多能性細胞の産生または生成に関係します。本明細書に記載された技術の態様は、ストレスは、細胞への外来遺伝子、転写物、タンパク質、核成分または細胞質を導入することなく細胞から多能性幹細胞の産生を誘導することができることを本発明者らの発見に基づいています、または細胞融合を必要とせず。いくつかの実施形態では、ストレスは、細胞質および/または細胞内のミトコンドリアの量の減少を誘導します。脱分化過程を誘発し、多能性細胞を生じます。いくつかの実施形態では、ストレスはストレスに暴露された細胞の少なくとも10％、例えば、細胞膜の破壊を引き起こします。これらの多能性細胞は、1つ以上の、三胚葉（インビトロおよび/またはインビボで）のそれぞれに分化する能力、インビボでの奇形腫様細胞塊の生成、および生存可能な胚を生成する能力を特徴としますおよび/またはキメラマウス。

【0045】本明細書に記載は、特定の環境ストレスと細胞の治療を実証する実験です含むが、細胞内の細胞質の量および/またはミトコンドリアを減らすストレスに限定されず、ミトコンドリア活性を減らすことができ、関連付けられたゲノムの脱メチル化領域は、脱分化は、細胞は、既知の脱分化経路のマーカーを表示させます。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞であり、細胞から多能性細胞、細胞の少なくとも約40細胞質の％および/またはミトコンドリアを除去することを含む方法を生成し、多能性マーカーを発現多能性または細胞を選択する方法であります組織には存在しません。また、本明細書に記載された細胞から多能性細胞を生成することができ、他のストレス処理があります。

【0046】便宜上、本明細書中で使用される特定の用語は、明細書では、実施例および添付の特許請求の範囲は、ここに集めます。特に明記しない、または文脈から暗黙のない限り、以下の用語および語句は、以下に提供される意味が含まれています。特に明記、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、用語または語句は、それが関連する技術分野で取得したことを意味を排除するものではありません。定義は、特定の実施形態を説明するのを助けるために提供され、そして本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本発明を限定するものではありません。別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって理解されるのと同じ意味を有します。

【0047】のように、本明細書において「含む」という用語を使用するか、または不特定の要素を含めると、まだオープンの方法または組成物に必須である組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分（複数可）、に関連して使用される「含みます」、必須のかどうか。本質的になる【0048】本明細書で使用する用語は、「所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の実質基本的な新規または機能的特性に影響を及ぼさない要素の存在（複数可）を可能にします。

本明細書に記載するように構成される【0049】用語「実施形態と説明に列挙されていない任意の要素の排他的である、組成物、方法、およびそれらの各構成要素を指します。 

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される[0050]、単数形 "、"

「、」とは、文脈が明確に指示しない限り ""複数の言及を含みます。従って、例えば、「方法」への言及は、1つ以上の方法を含み、および/または本開示を読めなど当業者に明らかとなるであろう、本明細書に記載されるタイプのステップおよび/または。同様に、単語「または」は、文脈が明らかに他を示さない限り、「および」を含むことが意図されます。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載します。略語「例えば」はラテン語の例を挙げるとから誘導され、かつ非限定的な例を示すために本明細書中で使用されます。このように、略語「例えば」という用語と同義である "例えば"。

【0051】細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、メルク・リサーチ・ラボラトリーズ、2006（ISBN 0-911910-19-0）発行の「診断および治療のメルクマニュアル」、第19版、で見つけることができます。ロバートS.ポーターら。（編）、および分子生物学の百科事典、ブラックウェルサイエンス社によって発行され、1994（ISBN

0- 632-02182-9）。分子生物学における一般的な用語の定義はまた、ベンジャミンレヴィン、遺伝子Xに見つかったジョーンズ＆バートレット社発行、2009することができます

（ISBN-10：0763766321）。ケンドルーら。（編）、分子生物学およびバイオテクノロジー：総合卓上参考書、VCH出版社、1995（ISBNによって公開

1- 56081-569-8）とカレント・プロトコルタンパク質科学2009年、ワイリーIntersciences、Coligan他編。 

【0052】特に明記しない限り、本発明は、Sambrookら、Molecular Cloning、例えば、記載されているように、標準的な手順を用いて行った：実験室マニュアルを（3編）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、USA（2001）。分子生物学のDavisら、基本メソッド、エルゼビア・サイエンス出版社、ニューヨーク、USA（1995）; 細胞生物学における最新プロトコール（CPCB）（フアンS. Bonifacinoら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社。。。）動物細胞の、そして文化：R.イアンFreshney、出版社によって基本技術のマニュアル：Wiley-リス; すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれている第5版（2005年）、動物細胞培養法（細胞生物学のメソッド、巻57、ジェニーP.メイザーとデビッドバーンズ編集、アカデミック・プレス、第1版、1998年）。

【0053】用語「減少」、「減少させる」、「減少」、および「減少」は、全ての基準に統計学的に有意な量だけ減少を意味するために本明細書で一般的に使用されています。しかし、誤解を避けるために、「減少させる」、「減少」、または「減少」は、典型的には、与えられた治療の非存在下と比較して少なくとも10％の減少を意味し、含むことができ、例えば、少なくとも約の減少20％>、少なくとも約25％、少なくとも約30％>、少なくとも約35％）、少なくとも約40％>、少なくとも約45％、少なくとも約50％>、少なくとも約55％、少なくとも約60％）、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％までを含む、例えば、特定のエンティティまたはパラメータの完全な欠如与えられた処置の非存在下、またはと比較して10-99％の間の任意の減少と比較して所定の治療の不在。

【0054】この用語は強化」、「増加」の増加」、または「「すべての一般静的にかなりの量の増加を意味するために使用され、任意の疑いを回避するために、用語は ""、 "増加の増加」、または「強化」とは、例えば、少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％の増加を参照レベルと比較して少なくとも10％の増加を意味する、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％）、または少なくとも約90％、または最大で100％の増加又は基準レベルと比較して10-100％の間の任意の増加を含みます、または少なくとも2倍、約、または少なくとも3倍、約、または少なくとも4倍、約、または少なくとも5倍、約、または少なくとも10倍の増加、または間の任意の増加を2倍および10倍又は参照レベルと比較して大きいです。 

疾患、障害または医学的状態に関連して使用される場合、オブジェクトがあることを特徴とする[0055]本明細書中で使用する用語は、条件のために治療的処置を参照して、「治療」、「治療」または「改善を」「治療」 、逆緩和、改善、阻害、症状又は状態の進行または重症度を遅くしたり、停止します。用語は、還元または状態の少なくとも1つの有害作用又は症状を緩和することを含む「治療します」。

治療は、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少している場合、一般的に「有効」です。症状の進行が減少または停止されている場合は別の方法として、治療が「有効」です。つまり、「治療」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、停止または進行の少なくとも遅延または治療を行わない場合に予想される症状の悪化だけでなく、含まれています。有益なまたは所望の臨床結果には、1つ以上の症状（複数可）、欠損の程度の減少の緩和が、これらに限定されない（すなわち、悪化しない）健康状態、疾患の進行の遅延または減速の状態を安定化し、そして症状の改善または緩和。治療はまた、死亡率が統計的に予想される時を超えて生存対象を含むことができます。

本明細書中で使用される【0056】用語「投与は、「方法や経路によって本明細書に記載の方法に従って製造された多能性細胞の配置および/または被験体へのそのような多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫を指し、これは所望の部位における細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらします。本明細書中に記載および/または多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫の方法に従って製造された多能性細胞を含む医薬組成物は、被験体において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができます。

【0057】本明細書で使用される「対象」は、ヒトまたは動物を意味します。通常、動物は、霊長類、齧歯類、家畜やゲーム動物と脊椎動物です。霊長類は、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカクザル、例えば、アカゲザルが含まれます。げっ歯類は、マウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギ、ハムスターが含まれます。国内およびゲームの動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼い猫、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚を含みます例えば、トラウト、ナマズ、サーモン。患者または被験体は、例えば、上記のすべてを上記のいずれかのサブセットが含まれています。特定の実施形態において、対象は哺乳動物、例えば、霊長類、例えばヒトです。

【0058】好ましくは、対象は哺乳動物です。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらに限定されるものではありません。ヒト以外の哺乳動物は、有利には、欠損、機能不全、および/または所与の細胞または組織または欠損の故障、誤動作、または幹細胞区画の障害に関連する疾患の動物モデルを表す対象として使用することができます。また、本明細書に記載される方法は、家畜および/またはペットを治療するために使用することができます。対象は、男性または女性であることができます。被験体は、以前と診断されたまたは罹患している又は欠陥を有すると同定、故障、および/または細胞型の障害、組織、または細胞区画またはそのような状態に関連する1つ以上の疾患または状態を幹されたものとすることができます、および必要に応じて、すでにそのような状態のための治療を受けている必要はありません。被験者はまた、既知の危険因子の改善を示していると診断されたまたは欠損、機能不全などの症状に罹患していると同定されたもの、および/または幹細胞区画の細胞型または組織または失敗することができるがこのような状態のための一つ以上の治療を受けた結果。あるいは、被験体は、以前にそのような状態を有すると診断されていない1つであることができます。例えば、対象は、状態またはそのような状態の危険因子を示さない被験体のための1つ以上の危険因子を示すものであることができます。

細胞または細胞集団に関連して使用される場合、[0059]本明細書で使用する場合、用語「選択」、、、選択分離、分離、および/または選択的に所望の特性を有する1つまたはそれ以上の細胞を増殖させることをいいます。本明細書で使用する用語「選択」は、必ずしも所望の特性のない細胞が提供される条件に伝播することができないことを意味するものではありません。

【0060】本明細書に用いられるように、「維持」細胞または細胞集団の生存能力を継続的に指します。維持人口は、代謝的に活性な細胞の数を持つことになります。これらの細胞の数は、少なくとも1日の期間にわたっておおよそ安定であることができるか、成長することができます。

本明細書中で使用される[0061]は、「検出可能なレベル」は、例えば中の物質または活性のレベルの基準レベルと区別するために、物質または活性の量を可能にする、試料中の物質または活性のレベルを指し、ストレスにさらされていない細胞。いくつかの実施形態では、検出可能なレベルが基準レベルよりも少なくとも10％大きいレベル、例えば10％以上、20％>以上、50％>以上、100％以上、200％>以上、または300％）であり得るか、または大きいです。

【0062】用語「統計的に有意な」または「大幅に」などの幹細胞マーカーまたは分化、例えばマーカーの濃度または量、統計的有意性を指し、一般的に参照の上または下2標準偏差（2SD）の差を意味マーカー。この用語には違いがあることを統計的証拠を指します。これは、帰無仮説が実際に真であるとき、帰無仮説を棄却する決定をする確率として定義されます。決定は、多くの場合、p値を使用して行われます。

特に指示がどこ用語によってすべての場合に修飾として[0063]実施例以外、または、本明細書中で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数字は理解されるべきである」について。」パーセンテージに関連して使用される場合、用語「約」は、±1％を意味し得ます。

【0064】他の用語は、本明細書に記載の技術の様々な態様の説明内で、本明細書に定義されています。 

本明細書に記載された技術の[0065]側面は、細胞と同様の用途から多能性細胞を生成する方法と、それらの多能性細胞を使用する方法に関するものです。再プログラミング因子の発現を増加させることに依存する多能性細胞（すなわち、人工多能性幹細胞またはiPS細胞）を生成する既存の方法とは対照的に、例えば、核酸を導入することによって、1つ以上の再プログラミング因子（例えばOct4の）メソッドをコードする構築物本明細書中に記載のストレスに細胞をさらすが、外国人の再プログラミングの俳優の導入を必要としません。

【0066】いくつかの実施形態では、ストレスは、細胞の細胞質の体積および/または細胞のミトコンドリアの数を減らすことができます。細胞の細胞質または細胞のミトコンドリアの数の量の減少は、細胞は少なくとも多能性の能力を取得する時のストレス応答を誘導します。本明細書に記載の一態様では、細胞の細胞質の少なくとも約40％を除去することからなる、及び細胞が組織内に存在しないであり、多能性を示す細胞を選択する、多能性細胞を生成する方法です。一態様では、本明細書に記載される本発明は、細胞は、組織中に存在しないであり、細胞の少なくともミトコンドリアの約40％を除去し、多能性を示す細胞を選択することを含む、多能性細胞を生成する方法に関する。

【0067】本明細書に記載の方法において使用される細胞、アッセイ、および組成物は、任意の種類の細胞であることができ、例えば成人の細胞、胚細胞、分化細胞、幹細胞、前駆細胞、および/または体細胞。細胞は、細胞が、胚性幹細胞または分化した体細胞であることができる、例えば、上述の条件の組み合わせによって記述することができます。本明細書に記載される方法、アッセイ、および組成物において使用される細胞は、被験体から得ることができます。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞です。いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞です。いくつかの実施形態において、細胞は、成体細胞です。いくつかの実施形態において、細胞は、新生児の細胞です。いくつかの実施形態では、細胞が胎児細胞です。いくつかの実施形態において、細胞は、羊膜細胞です。いくつかの実施形態において、細胞は、臍帯血細胞です。

【0068】「大人」から、または出生後の任意の時点での動物対象内由来組織や細胞をいいます。「胚」は、出産前の任意の時点での動物対象から、または内部に由来組織や細胞をいいます。

本明細書中で使用される[0069]、用語「体細胞」は、生殖細胞以外の細胞中に存在するか、着床前胚、またはin vitroでそのような細胞の増殖から得られた細胞から得られた細胞を指します。別の言い方をすれば、体細胞は、生殖細胞系列の細胞とは対照的に、生物の体を構成する任意の細胞を指します。哺乳動物では、（また「配偶子」として知られている）生殖細胞系列細胞は、全哺乳動物胚が発達するの接合体と呼ばれる細胞を生成するために受精時に溶融精子及び卵子です。哺乳類body-内の他のすべての細胞型は離れて精子と卵子から、それらが作られる細胞（配偶子母細胞）および未分化幹cells-は体細胞である：内臓、皮膚、骨、血液、および結合組織が全てです体細胞からなります。いくつかの実施形態において、体細胞は、胚からの中に存在するか得られず、インビトロでのそのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味し、それによって「非胚性体細胞」です。いくつかの実施形態では、体細胞は、内に存在するか、胚またはインビトロでそのような細胞の増殖から胎児や結果以外の生物から得られる細胞を意味していることにより、「成体の体細胞」です。成人および新生児または胚細胞は、メチル化パターンのような構造の違い、例えば、エピジェネティックな組織によって区別す​​ることができることに留意されたいです。いくつかの実施形態において、体細胞は、哺乳動物の体細胞です。いくつかの実施形態において、体細胞は、ヒトの体細胞です。いくつかの実施形態において、体細胞は、成体体細胞です。いくつかの実施形態において、体細胞は、新生児の体細胞です。

本明細書中で使用される[0070]は、「分化細胞」は、その運命またはその開発の前の時点でより機能的に、より特殊な細胞を指し、両方とも最終的に分化された細胞と細胞備えて最終的に分化していないものの、その開発の前の時点でより特殊化されています。、そして最終的に最終分化した細胞に特定の分化した細胞型へのコミットメントの増加度を有するセルに（例えば、幹細胞）コミットされていない細胞からの細胞の開発は進行性の分化またはプログレッシブコミットメントとして知られています。細胞個体発生の文脈では、形容詞「分化」または「分化」は、相対的な用語です。「分化細胞」とは、と比較されている細胞よりも発生経路のさらに下に進行している細胞です。したがって、細胞は、エンドに次に順番に（例えば、心筋細胞前駆体のような）さらなる経路下前駆細胞の他のタイプに分化することができる（例えば、中胚葉幹細胞など）系統拘束前駆細胞に分化する、ことができ、ステムステージ

特定の組織型に特徴的な役割を果たし、またはさらに増殖する能力を保持してもしなくてもよい分化細胞、。 

本明細書中で使用される[0071]は、用語「幹細胞」は、特定することなく、自己再生の性質を有しており、自然に、より分化した細胞型に分化する発生能を持つ未分化または部分的に分化した状態にある細胞を指します発生の可能性（すなわち、全能性、多能性、多分化など）に関する黙示の意味。自己再生することにより、幹細胞が増殖し、その発生能を維持しつつ、より多くのそのような幹細胞を生じることが可能であることを意味します。従って、用語「幹細胞」とは、実質的に分化することなく増殖し、特定の状況下で、能力を保持する、より特殊または分化した表現型に分化するように、特定の状況下では、発生能を有し、細胞の任意のサブセットを指します。用語「体性幹細胞」は、胎児、若年、および成体組織を含む非胚組織から誘導される任意の幹細胞を指すために本明細書中で使用されます。天然の体性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、および心筋を含む成体組織の様々なから単離されています。例示的な天然に存在する体性幹細胞としては、間葉系幹細胞および造血幹細胞、これらに限定されません。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、胚性幹細胞であり得ます。本明細書で使用するとき、「胚性幹細胞」は、任意の撮影前胚（例えばなど、胚盤胞）組織、胚組織、または胎児組織を含む組織受精後に形成されるからではなく、妊娠期間の終了前に由来する細胞を、幹細胞を指します妊娠中の時間、通常、必ずしもそうではないの前に約10〜12週の妊娠。最も頻繁には、胚性幹細胞は、初期胚または胚盤胞に由来する全能性細胞です。胚性幹細胞を含む適切な組織から直接得られた​​が、ヒト組織に限定されない、または確立された胚細胞株から得ることができます。トムソンらによって記載されるように一実施形態では、胚性幹細胞が得られます。。（米国特許番号5843780および6200806;科学282：11​​45、1998; CURRトップのDev BIOL 38：133のff、1998; PROCナショナル・科学アカデミー物理研サイエンスUSA 92：。。。。。。。7844、1995年に組み込まれていますその全体が本明細書に参照）。

[0072]例示的な幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋肉幹細胞、筋肉前駆幹細胞、内皮前駆細胞、骨髄幹細胞、軟骨形成幹細胞、リンパ系を含みます幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、中枢神経系幹細胞、末梢神経系幹細胞などが挙げられます。。隔離し、それらを培養するための方法を含む、幹細胞の説明は、他の場所、胚性幹細胞、方法およびプロトコル、Turksen編、ヒューマナ・プレス、2002年の間で、中に見出すことができます。ワイズマンら、アンヌ。牧師セル。デベロッパー。BIOL。17：387 403; Pittingerら、Science、284：143 47、1999; 動物細胞培養、マスターズ編、オックスフォード大学出版、2000; Jacksonら、PNAS 96（25）：14482 86、1999; ズクら、組織工学、7：211 228、2001（「ズクら。 "）; アタラら、特にチャプター33 41。および米国特許 番号5559022、5672346および5827735。

それらを単離するための方法を含む、間質細胞の説明、他の場所の中で、中に見出すことができる、Prockop、科学、276：71 74、1997; シースら、肝臓、31：235 40、2000; 細胞生物学カレント・プロトコール、Bonifacinoら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、2000（2002年3月を通じて更新を含みます）。および米国特許 米国特許第4963489。

【0073】本明細書では、「前駆細胞」、すなわち、全能性（発生の可能性に関する特定の暗黙の意味を持たせず、未分化または部分的に分化した状態で細胞を意味し、それは、少なくとも1以上の分化した表現型に分化する発生能を持っています多能性、多分化、など）、それは自己複製のプロパティを持っていません。従って、用語「前駆細胞」は、より特殊化または分化した表現型に分化するように特定の状況下では、発生能を有する細胞の任意のサブセットを指します。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、多能性幹細胞です。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、全能性幹細胞です。

【0074】用語「全能性」とは、体内の任意の組織または細胞型を生じることができる幹細胞をいいます。「多能性」幹細胞は、生殖細胞を除く身体中の細胞の任意の型を生じることができます。異なる細胞型のより小さなまたは限定された数を生じさせることができる幹細胞は、一般に、「多分化」と呼ばれます。したがって、全能性細胞がほとんどに上昇を与えることができる多能性細胞に分化する、すべてではないが、胎児の発育に必要な組織の。多能性細胞は、特定の機能を有する細胞を生じさせることにコミットしている多能性細胞へのさらなる分化を受けます。例えば、多分化造血幹細胞は、血液中の赤血球、白血球および血小板を生じます。

【0075】本明細書で使用する用語「多能性」は、すべての3つの胚細胞層の特徴的な細胞型に分化することが、異なる条件下で、容量の細胞を意味する（すなわち、内胚葉（例えば、腸組織）、中胚葉（例えば、血液、筋肉、および血管）、および外胚葉（例えば、皮膚および神経））。多能性細胞は、例えば、ヌードマウスの奇形腫形成アッセイ、使用し、3つ全ての胚葉に分化する能力によって主に特徴づけられます。多能性のための好ましい試験は三胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力の実証であるが、多能性はまた、胚性幹（ES）細胞マーカーの発現によって証明されます。

【0076】「ACC」と本明細書の実施例に記載の「STAP」細胞は、多能性細胞の非限定的な例です。「STAP幹細胞」は、多能性幹細胞の非限定的な例です。両方の細胞が本発明の目的のために好適に用いることができるので、用語多能性細胞と長期多能性幹細胞は、本明細書で互換的に使用され得ます。

【0077】本明細書で使用する用語「多能性」または「多能性状態は、「すべての3つの胚葉に分化する能力を有する細胞を指す：（血液、筋肉、および血管を含む）内胚葉（腸組織）、中胚葉、および外胚葉（例えば、皮膚や神経など）。 

【0078】「多能細胞」への言及で使用される用語「多分化」とは、すべての3つの胚葉由来の細胞のいくつかのすべてではないに分化することが可能である細胞を指します。したがって、多能細胞は、部分的に分化した細胞です。多能性細胞は、当技術分野において周知であり、多能性細胞の非限定的な例は、例えばなどの成体幹細胞、造血幹細胞および神経幹細胞を含むことができます。多能幹細胞は、多くの所定の系統の細胞のタイプが、他の系統のない細胞を形成できることを意味します。例えば、多能血液幹細胞は、血液細胞（赤、白、血小板など）の多くの異なるタイプを形成することができるが、それは神経細胞を形成することができません。用語「多分」は、全能性と多能性未満の発達汎用性の程度と細胞を意味します。

【0079】用語「全能性」とは、成人の体内の細胞ならびに胎盤などの胚体外組織のすべてを作る能力を記述した分化の程度と細胞を意味します。早期に切断された細胞がそうであるように受精卵（接合子）が全能性である（割球）

【0080】本明細書に記載の方法において使用される細胞は、組織内に存在しない細胞であることができます。本明細書で使用される場合、「組織」は、少なくとも1つの特定の機能の性能に一体化同様に特殊化した細胞の組織生体材料（例えば基、層、または凝集）を指します。細胞が組織上部構造から除去する、またはそうでなければインビボで存在編成上部構造から分離される場合、それらは組織中にはもはや存在しません。血液サンプルは、2つ以上の非同一の画分に分離され、または脾臓の刻み、パスツールピペットを用いて機械的に解離された場合、例えば、細胞はもはや組織に存在しません。いくつかの実施形態では、組織内に存在しない細胞は、単離された細胞です。細胞に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、機械的または物理的に、それらは通常、生体内で関連付けられたセルの他のグループから分離されている細胞を指します。細胞の他のグループから1つまたは複数の細胞を単離するための方法は当技術分野で周知です。参照、例えば、動物細胞の培養：基本的な技術のマニュアル（第3版）、1994年、RI Freshney（編）、ワイリー・リス社; 細胞：実験室マニュアル（第1巻）、1998年、DLスペクター、RDゴールドマン、LA L​​einwand（編）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス。動物細胞：文化とメディア、1994年、（株）DCダーリング、SJモーガン、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、

単離された細胞、必要に応じて他の細胞の存在下で、例えば、インビトロで培養されました。 

【0081】いくつかの実施形態では、細胞は、組織内に存在しない一方で、細胞の集団に存在します。いくつかの実施形態において、細胞集団は、細胞の集団です。本明細書で使用される「細胞集団」とは、少なくとも2細胞群、例えば2セル、3セル、4細胞、10細胞、100細胞、1000細胞、10,000細胞、100,000個の細胞またはその間の任意の値を指し以上の細胞。必要に応じて、細胞の集団が共通の起源を有する細胞、それらは同一の親細胞の子孫ことができ、例えばすることができ、それらはクローンすることができ、それらから単離されたまたは同一の組織から単離された細胞の子孫、またはそれらであり得ることができ単離されたまたは同一の組織試料から単離された細胞の子孫。細胞集団は、1以上の細胞型、例えば、1細胞型、2細胞型、3つの細胞型、4細胞種以上の細胞型を含むことができます。細胞の集団は、不均一または均一であることができます。それはである同じ細胞型の少なくとも90％、例えば90％、92％、95％）を、98％）、99％のO、または集団内の細胞の複数を含む場合、細胞の集団は、実質的に均一であることができます同じ細胞型。集団中に存在する細胞の90％未満が、同じ細胞型である場合、細胞集団は、不均一であることができます。

【0082】いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、非多能性細胞（例えば、分化した細胞）は、多能性表現型を前提とすることに関連することができます。いくつかの実施形態では、多能性細胞を生成する細胞が広い分化能を持つ表現型を想定させること、すなわち、より多くの多能性表現型を有する細胞を生成することを含むことができます。非限定的な例として、非常に小さな胚様細胞（VSEL）細胞は、多能性の代わりに、単能することができ、および/またはより密接おそらくVSELsのエピジェネティックな状態により（特定の分化した細胞型に分化する能力が制限されます）胚性幹細胞より分化した細胞に似ています。本明細書に記載の方法に従って、限定された分化能を有する単能性細胞および/または細胞は、より多くの多能性表現型を仮定させることができます。多くの多能性表現型は二つの単能性細胞を、例えば分化した細胞型の大多数に多くの多能性及び/又はされる系統の分化した細胞型のより多くに分化することができるものを区別することができる表現型であることができます多能性細胞は、単能性細胞よりも多能性です。

【0083】本明細書に記載の多能性細胞（またはそれ以上の多能性細胞）を生成する方法は、細胞から細胞質の一部を除去および/または細胞からミトコンドリアの除去、例えば、備えることができます。いくつかの実施形態では、細胞から細胞質またはミトコンドリアの一部の除去は、細胞の部分的なエピジェネティックな制御を削除します。>いくつかの実施形態では、細胞質の少なくとも約40％が除去され、例えば、少なくとも約40％>、少なくとも約50％）、少なくとも約60％>、少なくとも約70％>、少なくとも約80％ 、細胞の細胞質の少なくとも約90％>以上が除去されます。いくつかの実施形態では、60％の間、細胞の細胞質の80％が除去されます。いくつかの実施形態において、ミトコンドリアの少なくとも約40％が除去され、例えば、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90細胞のミトコンドリアの％以上が除去されます。いくつかの実施形態では、50％の間、細胞のミトコンドリアの90％が除去されます。

[0084]ストレスにセルを施し、および/または細胞から細胞質またはミトコンドリアの一部を除去する方法は、致死性の閾値以下の細胞の膜に細孔および/または破裂の原因になります任意の環境刺激することができます。ストレスは、組織または細胞培養において非生理学的ストレスを含むことができます。適切な環境刺激の非限定的な例には、極端な温度、分解、粉砕、物理的ストレス、過剰浸透、ハイポ浸透、膜損傷の外傷、機械的刺激、化学的暴露、超音波刺激、酸素欠乏、栄養欠乏、放射線暴露を含みます、毒素、極端なイオン濃度、活性酸素、紫外線曝露、強い可視光、本質的な栄養の欠乏、または非生理的酸性環境。いくつかの実施形態では、1つの環境刺激を細胞に適用することができます。一部では

実施形態は、複数の環境刺激を細胞に適用することができ、例えば、2刺激、3刺激、4刺激以上の刺激を適用することができます。複数の環境刺激は、同時にまたは別々に適用することができます。

【0085】いくつかの実施形態では、ストレスがストレスに暴露された細胞の少なくとも10％で膜破壊の原因となるストレスすることができます。本明細書で使用される場合、「膜破壊」は、妥協破裂、または細胞小器官および/または細胞性物質の検出可能量を放出するのに十分な孔またはギャップを形成するように膜を破壊すること、を含むが、細胞外にミトコンドリアおよびDNAに限定されるものではないことをいいます環境。

細胞物質の放出を検出する方法は、例えば、ミトコンドリアは、当技術分野で公知であり、本明細書の他の箇所に記載されています。放出された細胞材料は、無料またはカプセル化または膜に囲まれてすることができます。

[0086]ストレスがストレスに曝された細胞の少なくとも10％、例えば10％以上、20％>以上、30％>以上、40％>以上50％>以上で膜破壊を引き起こす可能性がありますが60％>以上、70％>以上、80％>以上、または90％>以上。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように、細胞がより多くの多能性を作られるように、ストレスにさらされた細胞は、同じタイプ及び特性の細胞であることができ、例えば、細胞の種類に適したストレスは、細胞の別のタイプに適していないかもしれません。

【0087】細胞をストレスにさらされている時間の長さは、使用されている刺激に応じて変えることができます。本明細書に記載の方法に従って細胞を強調するために、低栄養状態を使用する場合、例えば、細胞は、1週間以上、例えば、1週間、2週間、または3週間以上の低栄養条件下で培養することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約3週間の低栄養条件下で培養されます。別の非限定的な例において、本明細書に記載の方法に従って、低pHまたは低酸素状態に曝露された細胞は、分長く露出させることができ、例えば、数時間を含む、少なくとも2分間、例えば少なくとも5分間で用少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも6時間以上20分以上、。

【0088】多能性細胞の生成を誘発する機械的刺激が機械的に膜の完全性を崩壊させるであろう細胞膜と物質又は表面の接触の任意の形式を含めることができます。機械的刺激は、剪断応力および/または高圧に細胞をさらすことを含むことができます。機械的刺激の典型的な形でトリチュレーションです。粉砕し、粉砕および/または摩擦を経由して、粒子の表面を研磨する工程です。細胞の粉砕のための方法の非限定的な例は、細胞は、デバイスがセルのサイズよりも小さい開口を有する装置を通過させることです。例えば、細胞は、ピペットの内部空間の少なくとも一部が細胞の直径よりも小さい直径を有する、ピペットを通過するように、真空圧及び/又は流体の流れによって、引き起こされ得ます。いくつかの実施形態では、セルは、セルのサイズより小さい開口部を有する少なくとも1つのデバイスを通過します。いくつかの実施形態では、細胞は徐々に小さく開口を有する複数のデバイスを通過します。いくつかの実施形態において、細胞は、5分以上、例えば、5分、10分、20分、30分、または60分間磨砕することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、50μιηの内径パスツールピペットに通して磨砕することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、20分間50μιηの内径パスツールピペットに通して磨砕することができます。

【0089】多能性細胞としては、例えば、特定の化学物質への曝露、または物理化学的条件（例えば、高または低pH、浸透圧ショック、極端な温度、酸素欠乏など）を生成する細胞を誘導するために必要な応力を加える他の方法を。多能性細胞の生成を誘導し、この種の治療法などは、以下にさらに議論されます。化学物質の曝露は、例えば、pHは、浸透圧、および/または細胞膜の完全性を破壊するか、損なう孔形成化合物の任意の組合せを含むことができます。非限定的な例として、細胞はunphysiolosically酸性環境または低pH、ストレプトリジンO、または蒸留水（すなわち、浸透圧衝撃）に暴露することができます。

【0090】低pHが例えば6.8より低いpHを含むことができ、6.7、6.5、6.3、6.0、5.8、5.4、5.0、4.5、

4.0、または低いです。。いくつかの実施形態では、低pHは、約3.0から約6.0です。いくつかの実施形態では、低pHは、約4.5から約6.0です。いくつかの実施形態では、低pHは5.4から5.8です。いくつかの実施形態では、低pHは5.4から5.6です。いくつかの実施形態では、低pHは約5.6です。いくつかの実施形態では、低pHは約5.7です。いくつかの実施形態では、低pHは約5.5です。いくつかの実施形態では、細胞は1日以下で、2日間以下で、3日以下で、4日以下のために、6日間以下で、例えば、数日までのための低pH条件に暴露することができます、 12時間以下、6時間以下で、3時間以下、2時間以下、1時間以下で、30分以下、20分以下、または10分未満。いくつかの実施形態において、細胞は、3日以下で5.4〜5.6のpHに暴露することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、3日以下、約5.6 6.8からのpHに曝露することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、1時間以下で6.8、約5.6からのpHを露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約30分間、6.8、約5.6からのpHを露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約20分間、6.8、約5.6からのpHを露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、3日以下、約5.6 5.8からのpHに曝露することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、1時間以下で5.8、約5.6からのpHを露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約30分間、5.8、約5.6からのpHを露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約20分間、5.8、約5.6からのpHを露出させることができます。【0091】いくつかの実施形態では、細胞は、多能性細胞の生成を誘導するためにATPに暴露することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約200mMの約20μΜの濃度でATPを露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約20mM、約200μΜの濃度でATPを露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約2.4ミリモルの濃度でATPを露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、HBSS中で希釈ATPに暴露することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも1、1分以上、例えば、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも5分間、少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも45分間、ATPに暴露することができます時間以上。いくつかの実施形態において、細胞は、約30分〜約5分のためにATPに暴露することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約15分間、ATPに暴露することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約15分間、約2.4 mMのATPに暴露することができます。

【0092】いくつかの実施形態では、細胞は、塩化カルシウムに露出させることができる₂多能性細胞の生成を誘導します。いくつかの実施形態では、細胞を塩化カルシウムに暴露することができる₂〜約200 mMの約20μΜの濃度で。いくつかの実施形態では、細胞を塩化カルシウムに暴露することができる₂約20mM、約200μΜの濃度で。いくつかの実施形態では、細胞を塩化カルシウムに暴露することができる₂約2mMの濃度で。いくつかの実施形態では、細胞を塩化カルシウムに暴露することができる₂ HBSSで希釈しました。いくつかの実施形態において、細胞は、塩化カルシウムに暴露することができる₂ 1日以上、例えば、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間以上。いくつかの実施形態では、細胞を塩化カルシウムに暴露することができる₂ 3週間、約1週間のため。いくつかの実施形態では、細胞を塩化カルシウムに暴露することができる₂約2週間。いくつかの実施形態において、細胞は、約2mMのCaClに暴露することができる₂約2週間。いくつかの実施形態において、細胞は、約2mMのCaClに暴露することができる₂、約1週間。

【0093】孔形成化合物の例としては、ストレプトリシンが含まO（SLO）、サポニン、ジギトニン、フィリピン、AeのI、イソギンチャクの細胞溶解素、アエロリジン、amatoxin、amoebapore、アメーバ同等でない、brevinin-LE、brevinin-2Eからamoebapore homoiog、 barbatoiysin、Enterococcusfaecalis、デルタ溶血素、ジフテリア毒素の細胞溶解素。コレラ菌、equinatoxin、ヨンエomonas hydrophiia、ストレプトコッカス・intermedins、レンチウイルス溶解性ペプチド、Aciinobacillusのaciinomycetemcomitans、magaimn、メリチン、膜関連リンホトキシン、Metのロイコトキシンのintermedilysin esculentin、granuiysin、ビブリオ・パラaemolyticiisの溶血素のエンテロトキシンのエルトールのeytolysiii -エンケファリン、フラグメント4、NKIysirs、paradaxin、黄色ブドウ球菌、クロストリジウム・セプチカムのアルファ細胞溶解素のアルファ細胞溶解素をneokyotorphin、フラグメント3をneokyotorphin、断片2をneokyotorphin、断片1をneokyotorphin、neokyotorphin。バチルス・チューリンゲンシス毒素、eolicin、補体、デフェンシン、histolysin、リステリオ、magainm、メリチン、肺剥離術酵母キラートキシン、valinomycirs、ピーターソンのクラウンエーテル、パーフォリン、perfringolysm Q、ウェルシュ菌のθ毒素、phallolysin、phallotoxiii、および他の分子は、そのようなレーゲンらのものdescriベッドとして。BIOCHEM Biophys RES共通1989 159：566から571：その全体が参照により本明細書に組み込まれます。孔形成化合物の精製または合成する方法は、当業者に知られています。また、細孔formmg化合物は、市販されている、例えばストレプトリジンO（カタログ番号S5265、シグマアルドリッチ、セントルイス、O）。非限定的な例として、細胞は、約5分以上）SIXに露出させることができ、例えば、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも20分間、少なくとも30分間、少なくとも45分間、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、またはそれ以上は、いくつかの実施形態において、細胞を2時間、約30分のためのSLOに曝露されます。いくつかの実施形態において、細胞は、約50分間、SLOにさらされています。非lixuitmg EX十分なにより、細胞は、1mgのnilに、約10ng / mlでの濃度でSLOに露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は100、約1 ^ IG / RNLからの濃度でSLOに露出することができ_、 UG / mLのいくつかの実施形態において、細胞は、約10 .G / mLでSLOに露出させることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約50分間、約10g / RNLでSLOに露出させることができます。

多能性細胞の生成を誘導[0094]酸素欠乏条件は、例えば、10％酸素以下で細胞を培養、低酸素条件下で細胞を培養することを含むことができます。いくつかの実施形態では、細胞を、5％酸素以下で培養されます。低酸素条件下での培養の長さは1時間以上、例えば、1時間、12時間、1日、2日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月またはそれ以上であることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、1ヶ月に1週間のための低酸素条件下で培養することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約3週間の低酸素条件下で培養することができます。

多能性細胞の生成を誘導[0095]栄養欠乏条件は、細胞の成長に有益である任意の因子または栄養素の不足を含めることができます。いくつかの実施形態では、栄養欠乏条件は、例えば、FBSまたは成長因子などのさらなる補助剤なしに、基礎培地、例えばF12またはDMEM中で細胞を培養することを含みます。栄養欠乏条件下での培養の長さは1時間以上、例えば、1時間、12時間、1日、2日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月またはそれ以上であることができます。いくつかの実施形態において、細胞は、1ヶ月に1週間のための栄養欠乏条件下で培養することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約2週間、栄養欠乏条件下で培養することができます。いくつかの実施形態において、細胞は、約3週間、栄養欠乏条件下で培養することができます。いくつかの実施形態では、栄養欠乏条件は、所定の細胞型のための1つ以上の成長因子の標準濃度の50％未満でない成長因子または条件の条件を含むことができます。

【0096】多能性細胞の生成は、低温または高温のいずれかへの曝露を含むことができ、誘導極端な温度への暴露。哺乳類細胞のために、極端に低い温度が35℃以下の温度、例えば、34°C、33°C、32°C、31°C、以下にすることができます。いくつかの実施形態では、極端に低い温度が氷点下の温度であることができます。細胞の凍結は、氷晶によって膜穿孔を引き起こし、細胞質を減少させるための手段を提供することができます。哺乳動物細胞の場合、極端に高い温度が42℃以上の温度、例えば43℃、44℃、45℃、46℃以上とすることができます。いくつかの実施形態では、極端な高温は、約85℃以上の温度とすることができます。極端な温度下での培養の長さは、例えば20分以上、20分、30分、1時間、12時間、1日、2日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月またはそれ以上であることができます。一般的に、多能性細胞の生成を可能にするために許容される暴露明らかに、温度が高いほど、より短いです。

本明細書に記載する方法で使用することができる応力の【0097】さらなる例としては、超音波刺激および放射線治療が、これらに限定されません。 

【0098】いくつかの実施形態では、ストレスにさらされた後、細胞は、本明細書に以下に記載される方法に従って選択の前に培養することができます。細胞は、例えば、ストレス刺激を除去し、細胞を少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも1日間培養される、前の選択には、少なくとも1時間培養することができます少なくとも2日、少なくとも7日以上前に、本明細書に記載されるように選択します。非限定的な例として、細胞は、約50分間、SLOに露出することができ、前の選択に約7日間SLOを含まない培地中で培養しました。いくつかの実施形態において、培地は、分化因子を含有するまたは分化を促進しない選択の前に培養した細胞を使用しました。いくつかの実施形態において、培地は、幹細胞および/または多能性細胞の培養に適したものです。このような媒体の例としては、以下に記載されています。

【0099】いくつかの実施形態では、細胞内の細胞質の量が削減されます。細胞における細胞質の減少は、細胞の大きさを監視することによって決定することができます。セルサイズを決定する方法は当業者に知られており、非限定的な例として、細胞蛍光分析を含みます。簡単に、単一細胞を、フロマックス™ソフトウェアを使用してDAKO GALAXY™（DAKO）分析器で濾過し、測定された、例えば、ヨウ化プロピジウムで染色します。細胞蛍光分析は、セルの大きさを確立するために行うことができます。事前定義されたサイズのマイクロビーズは、等張リン酸生理食塩水（pH7.2）中に再懸濁し、細胞蛍光分析を用いて球に含まれる細胞の大きさを比較するための基準として使用されています。細胞およびビーズの両方が（細胞の粒度を表す、細胞およびビーズの大きさ、および側方散乱を示す、前方散乱）の設定と同じ機器を用いて分析されます。セルサイズは、y軸上のx軸、前方散乱値にビーズサイズを用いた曲線に基づいて計算することができます。

[00100]いくつかの実施形態では、細胞内のミトコンドリアの量が低減されます。 

細胞中のミトコンドリアの数を決定する方法は、当業者に知られており、ミトコンドリア特異的色素で染色し、顕微鏡下で見たとき、細胞あたり可視ミトコンドリアの数をカウントを含みます。ミトコンドリア特有の色素が市販されており、例えばのMitoTracker™（カタログ番号M7512インビトロジェン;グランドアイランド、NY）。いくつかの実施形態において、ミトコンドリアの数またはミトコンドリア特異的色素からのシグナルの強度は、本明細書で上述した方法で処理した後、少なくとも40％減少させることができます。いくつかの実施形態では、細胞が選択されるミトコンドリアの数、または本明細書で上述した方法で処理した後、少なくとも40％減少し、ミトコンドリア特異的色素からの信号の強度。

[00101]ミトコンドリアおよび/または膜破壊の量はまた、細胞外環境でレドックス活性を測定することによって検出することができます。ミトコンドリアは、本明細書に記載のストレスによる細胞外環境に放出されるように、細胞外環境におけるROSのレベルを増加させることができ、与えられた応力の効果を測定するために使用することができます。

[00102]本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの態様において、細胞は、LIF（白血病阻害因子）の存在下でながら応力を受けることができます。 

いくつかの態様では[0103]、細胞質および/または細胞のミトコンドリアの一部を除去した後、本方法はさらに、多能性を示す選択細胞を含みます。多能性細胞は、細胞ディスプレイマーカー、表現型、または多能性細胞の機能を選択することによって選択することができます。選択した細胞は生存する（複数の）所望の特性を有する細胞を単離し、所望の特性を示す細胞を増殖させるかの条件下で、未知の特性を有する細胞集団を培養するように含み、かつ/または所望有さないこれらの細胞よりも速い速度で伝播することができます特性（複数可）。マーカーおよび多能性細胞の特性の非限定的な例には、以下に記載されています。いくつかの実施形態では、多能性のための細胞を選択するのOct4を発現する細胞を選択し、少なくとも部分的に含みます。いくつかの実施形態では、多能性のための細胞を選択するのNanogを発現する細胞を選択し、少なくとも部分的に含みます。いくつかの実施形態では、多能性のための細胞を選択するのOct4、Nanogの、E-カドヘリン、および/またはSSEAを発現する細胞を選択し、少なくとも部分的に含みます。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、これらのマーカーおよびFACSに特異的な抗体を用いて、SSEA-1およびE-カドヘリンを発現する細胞を選択することによって選択することができます。当技術分野で公知および/または本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、細胞は、FACSまたは他の細胞選別装置を用いて、サイズに基づいて選択することができます。細胞は培養皿に付着することができないことによって選択することができます。

[00104]細胞は、ストレスにさらされた後に小さいサイズに基づいて選択することができます。つまり、多能性へと進行する細胞は、それらよりも小さい強調

非多能性体細胞前駆体。いくつかの実施形態では、8未満μιηの直径を有する細胞は、8μιη以下、7μιη以下、6μιη以下、5μιη以下、以下の直径を有する、例えば、細胞を選択します。細胞は、短期間（数日例えば、数分間）またはストレス処理後休止させた後の、培養された後、大きさに基づいて選択することができます。いくつかの実施形態では、細胞はすぐにストレス処理後のサイズに基づいて選択することができます。細胞は、フィルターの使用EGまたはFACSによって、当技術分野で公知の任意の方法によって大きさに基づいて選択することができます。

[00105]本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って生成された多能性細胞は、多能性細胞（幹細胞、すなわち増殖）の伝播を可能にするために培養することができます。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って生成された多能性細胞をインビトロで維持することができます。一態様では、本明細書に記載の技術は、多能性細胞、および/または、少なくとも部分的に分化した子孫細胞を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、多能性細胞および/または少なくとも部分的に分化した子孫は、その細胞株として、例えば、インビトロで維持することができます。本明細書で以下に記載されるような細胞株は、所与の疾患および/または幹細胞を調節する薬剤のためおよび/またはテスト候補薬剤、例えば治療薬をスクリーニングするために使用することができます。例えば、天然に存在する細胞または組織タイプの故障又は天然に関連する疾患いくつかの実施形態では、多能性細胞および/またはその疾患を有する被験体から得られた細胞に由来することができ、少なくとも部分的に分化した子孫において多能性および/または多能細胞（本明細書で以下に記載されるように）、および/または遺伝的変異、例えば、癌を有する細胞が関与する疾患。本明細書に記載の組成物は、疾患モデル、創薬、診断、および個別化治療に、例えば、使用することができます。

増殖およびまたは幹細胞および/ ​​または多能性細胞の維持に適した[00106]条件は、当技術分野で知られています。幹細胞の増殖は、実質的に非限定的な例として分化を誘導または許容せずに細胞数の拡大を可能にする、多能性細胞の増殖に適した条件は、LXL 0めっきセルを含む⁶ 1、V：F12 / DMEM中の細胞/ cm（1 / v）を、2％B27、20 ngの/ mLの塩基性線維芽細胞成長因子、および10ng / mLの上皮成長因子を補充しました。培地の約50％が、培養期間中2~3日ごとに交換することができます。いくつかの実施形態では、幹細胞および/ ​​または多能性細胞の増殖に適した条件は、（B27-LIFで細胞を培養することを含む、すなわちLIFを含む無血清培地（1 XII単位/ mL、Chernicort;カタログ番号：

ESG1107 EMDミリポア、ビレリカ、MA）およびB27サプリメント（カタログ番号：0080085-SA; 

インビトロジェン; グランドアイランド、NY）仁、S.らに記載されているように。ジーンズ・アンド・ディベロップメント2004年18、1806年から1811年; これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれます。本明細書に記載の細胞を培養するのに適した他の媒体は、例として本明細書中で、例えばES確立培地、2I、3IおよびACTH、ES培養条件、ES-LIF、胚性神経幹細胞培養条件、及びEpiSCs培養条件に記載されています。いくつかの実施形態では、多能性細胞の増殖または維持のための条件は、培養をLIF（白血病阻害因子）の存在下で細胞を含むことができます。

[00107]伝播中に、本明細書に記載の方法に従って生成された多能性細胞は、同一の多能性幹細胞マーカーを発現し続けます。 

多能性幹細胞マーカーの非限定的な例としては、SSEA-1、SSEA-2、SSEA-3、SSEA-4（集合的にSSEAと呼ぶ）、AP、Eカドヘリン抗原でのOct4、Nanogの、Ecatl、Rexl、Zfp296を含みます、GDF3、Dppa3、Dppa4、Dppa5、Sox2の、Esrrb、DNMT3B、Dnmt31、Utfl、教える、Batl、FGF4、ネオ、のCripto、Cdx2の、およびSlc2a3。細胞は、多能性幹細胞マーカーを発現しているかどうかを決定する方法は当業者に公知であり、例えばされ、RT-PCR、レポーター遺伝子構築物の使用（記載のOct4-GFP構築物の、例えば式本明細書において、目的の細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いたFACSまたは蛍光顕微鏡検査）、およびFACSまたは蛍光顕微鏡を用いて結合されます。

[00108]多能性細胞マーカーは、細胞に比べて、細長いテロメアを含みます。

テロメアの長さは、ゲノムDNAを単離し、このようなHinflとRSALなどの制限酵素でのgDNAを消化し、そしてテロメア長アッセイ試薬でテロメアを検出することによって、例えば、決定することができます。このような試薬は、当技術分野で公知であり、市販されており、TELOTAGGG™テロメアLENGTHアッセイキット（カタログ番号などれています

12209136001ロシュ; インディアナポリス、IN）。

[00109]いくつかの態様において、本明細書に記載の方法に従って処理された細胞は、開示された方法に従って処理される前に行ったよりもより密接に胚性幹細胞のエピジェネティックな状態に類似するように変更することができます。細胞のエピジェネティックな状態は、ゲノムのヌクレオチド配列の変化とは対照的に、ゲノムのマーキング化学物質を指します。エピジェネティックマークは、DNAメチル化（インプリント）ならびに履歴などのDNA、に関連するタンパク質のメチル化やアセチル化を含めることができます。用語「DNAメチル化」は、DNA中の特定の塩基のメチル（Cf¾）グループの付加を指します。哺乳動物において、メチル化は、これはグアニン（CPG）が続いているシトシン上の5位置でほぼ独占的に発生します。いくつかの実施形態では、エピジェネティックな状態は、エピジェネティックなメチル化パターン、例えば、DNAのメチル化パターンを含むことができます。エピジェネティックなマーキングの存在及び位置を決定するためのアッセイは、当技術分野において公知で、及び本明細書の実施例2に記載したように、例えば重亜硫酸塩シークエンシングを含むことができます。簡潔には、DNAを用いて処理され

CpGenome™DNA修飾キット（ケミコン、テメキュラ、カリフォルニア州）と関心領域（例えば、Nanog及びOct4の遺伝子）から増幅し、配列決定されています。 

[00110]本明細書に記載の技術のいくつかの態様は、本明細書に記載の方法により製造多能性幹細胞を用いたアッセイに関する。例えば、本明細書に記載の方法によって製造さ多能性幹細胞は、スクリーニングおよび/または生存性、分化、または多能性幹細胞の増殖を調節する薬剤を同定するために用いることができます。このようなアッセイは、候補薬剤と、本明細書に記載され、候補薬剤と接触させ、多能性細胞の生存、分化および/または増殖が生存能力、分化および/または増殖によって異なるかどうかを決定する方法に従って製造多能性細胞を接触させることを含むことができ多能性細胞は、候補薬剤と接触していません。いくつかの実施形態では、薬剤は、多能性幹細胞の生存、分化および/または増殖を増加させることができます。いくつかの実施形態では、薬剤は、多能性幹細胞の生存、分化および/または増殖を減少させることができます。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、相乗的又は拮抗的な作用を決定するために、またはプール内の候補薬剤をスクリーニングするために、例えば、複数の候補薬剤と接触させることができます。

[00111]候補薬剤は、すなわち生きている生存可能である多能性細胞の数は、その不在の候補薬剤の存在下で高いか低い場合。生産多能性細胞の生存性を調節する薬剤として同定されます 細胞の生存率を決定する方法は、当該分野で周知であり、生細胞のマーカーからの信号の強度を検出することにより、少なくとも2つの時点での生存細胞の数を決定する非限定的な例として、または生細胞マーカーによって染色された細胞の数または割合。ライブ細胞マーカーは、例えばさきがけBLUE™（カタログ番号A-13261; Life Technologies社、ニューヨーク州グランドアイランド）、市販されています。候補薬剤は、所定の時間内に生成さ子孫細胞の数が候補の存在下でより高いまたはより低い、すなわち、多能性細胞の増殖の速度が、変更された場合に生成多能性細胞の増殖を調節する薬剤として同定されますエージェント。細胞の増殖速度を決定する方法は、当該分野で公知であり、非限定的な例として、時間をかけて生細胞数の増加を決定しています。[00112]候補薬剤は、多能性細胞の分化の速度または文字が候補薬剤の存在下でより高いまたは低い場合、多能性細胞の分化を調節する薬剤として同定されます。非限定的な例として、細胞の分化の速度またはキャラクターを決定する方法は当技術分野で公知であり、特定の系統のマーカーまたは形態を検出し、細胞の数および/または出現の割合を比較します集団でのこのようなマーカーまたは形態を有する細胞を候補薬剤と接触していない集団に候補薬剤と接触しました。マーカーおよび様々な細胞運命系統と成熟細胞型の形態学的特徴は、当技術分野で知られています。非限定的な例として、中胚葉細胞は、アクチン、ミオシン、およびデスミンの発現による多能性細胞から区別されます。軟骨細胞はサフラニン0で染色することにより、それらの前駆細胞型と区別することができ、または

FASTGREEN™色素（フィッシャー、ピッツバーグ、PA; F99）。骨細胞は、アリザリンレッドS（;カタログ番号A5533ミズーリ州セントルイスSigma）で染色することによって、それらの前駆細胞型から区別することができます。

[00113]いくつかの態様において、候補薬剤は、腫瘍幹細胞の潜在的な阻害剤であることができ、例えば、本明細書に記載される方法は、成熟した腫瘍細胞から多能性細胞を作成するために使用される、および作成を阻害する薬剤をスクリーニングするために使用することができ、および/または腫瘍細胞の生存率。本明細書に記載される方法はまた、成熟した腫瘍細胞を死滅させるが、腫瘍幹細胞の発達および/または生存を促進しない薬剤をスクリーニングするために使用することができます。

[00114]いくつかの実施形態では、多能性細胞は、一つ以上の候補薬剤と接触され、特定の細胞系統または成熟した細胞型への分化を促進する条件下で培養しました。分化に適した条件は当技術分野で公知です。培地は3日ごとに交換して非限定的な例として、中胚葉系列への分化に適した条件は、20％ウシ胎児血清（FCS）を補充したDMEMを含みます。非限定的なさらなる例として、神経系統への分化に適した条件は、F12にオルニチンでコーティングしたチャンバースライドにプレーティングセルを含む/ DMEM（1：1、v / v）の2％B27、10％> FCS、10を補充しましたngの/ mlのbFGF、および20 ng /メートルのLEGF。培地は3日毎に交換することができます。

本明細書中で使用される[0115]、「候補薬剤」は、細胞、組織または対象に投与される通常存在またはレベルで存在しないではない任意の実体を指します。候補薬剤は、以下を含む群から選択することができる化学物質。小さい有機または無機分子; 核酸配列。核酸類似体。タンパク質; ペプチド; アプタマー; ペプチド模倣体、ペプチド誘導体、ペプチド類似体、抗体。イントラボディ; 生体高分子、例えば、細菌、植物、真菌、または動物細胞もしくは組織などの生物学的材料から作製された抽出物。天然または合成組成物またはそれらの機能的断片。いくつかの実施形態において、候補薬剤は、限定されないが、合成および天然に存在する非タンパク質性実体を含むが、任意の化学物質または部分です。特定の実施形態において、候補薬剤は、化学部分を有する小分子です。例えば、化学的部分は、非置換または置換アルキル、芳香族、またはこれらのマクロライド、leptomycinsおよび関連天然産物または類似体を含むヘテロシクリル部分が含まれます。

候補薬剤は、所望の活性および/または特性を有することが知られていることができ、または多様な化合物のライブラリーから選択することができます。 

[00116]候補薬剤は、多能性細胞の生存、増殖、および/または分化を調節する能力についてスクリーニングすることができます。一実施形態では、候補薬剤は、上記および本明細書の実施例に記載生存能力、分化および/または増殖のためのアッセイを用いてスクリーニングされます。

[00117]一般に、化合物は、任意の細胞機能を調節することができる濃度、遺伝子発現または適切な期間にわたって対照に対するタンパク質活性に試験することができます。いくつかの実施形態において、化合物は、約lOOOmM約0は1nMの範囲の濃度で試験します。一実施形態において、化合物は、約Οの範囲で試験されます。5μΜ約ΙμΜ20μΜ約、Ο.ΙμΜ約10μΜ約へ、またはΟ.ΙμΜ程度です。

[00118]実施される特定の実施形態に応じて、候補または試験薬剤が溶液中に自由に設けることができ、又は担体、または固体支持体、例えば、ビーズに結合することができます。適切な固体支持体の数は、試験剤の固定化のために使用することができます。適切な固体支持体の例には、アガロースとしては、セルロース、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（PEG）、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム（例えば、セファデックス、セファロース、として市販されています）、

polyaminemethylvinyletherマレイン酸共重合体、ガラスビーズ、アミノ酸共重合体、エチレン - マレイン酸共重合体、ナイロン、絹などがまた、本明細書に記載される方法のために、試験薬剤は、個々にスクリーニング、またはグループまたはプールであることができます。グループのスクリーニングは、効果的な試験薬剤のヒット率は1が与えられたグループに対して複数の肯定的な結果を期待していないように、低くなることが期待されている場合に特に有用です。

[00119]小分子を開発するための方法を、ポリマーおよびゲノムベースのライブラリが記載されている、例えば、丁で、ら。Jアム。CHEM。Soc。124：1594から1596（2002）、リン、ら、J.アム。。CHEM。Soc。123：8155から8156（2001）。市販の化合物ライブラリーは、例えば、ArQule（マサチューセッツ州）から入手することができ、Invitrogen社（カリフォルニア州カールスバッド）、ライアン・サイエンティフィック（マウントプレザント、サウスカロライナ州）、およびエンツォライフサイエンス（ファーミングデール、NY）。これらのライブラリは、多能性幹細胞の生存率、増殖、および/または分化を調節するメンバーの能力についてスクリーニングすることができます。候補薬剤は、天然に存在するタンパク質またはその断片であることができます。そのような候補薬剤は、天然供給源、例えば、細胞または組織溶解物から得ることができます。ポリペプチド薬剤のライブラリーは、商業的に入手可能であるか、または日常的な方法を用いて生成されたcDNAライブラリーから、例えば、製造することができます。候補薬剤はまた、約5〜約20個のアミノ酸が好ましいから約7から約15、特に好ましいのあるペプチド、例えば、約5〜約30個のアミノ酸からのペプチドであることができます。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または「偏った」ランダムペプチドであることができます。いくつかの方法では、候補薬剤は、ポリペプチドまたはタンパク質です。ペプチドライブラリー、ペプチドまたは他の化合物の例えばコンビナトリアルライブラリーは、任意の位置で無シーケンスの好みや定数で、完全に無作為化することができます。ライブラリをバイアスすることができる代替的に、すなわち、配列内のいくつかの位置はどちら一定に保持されるか、または限られた数の可能性から選択されます。例えば、いくつかの場合において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が交差するため、システインの創出に向けて、（小さなまたは大きないずれかの）立体的にバイアスされた疎水性アミノ酸、親水性残基、残基、例えば、定義されたクラス内でランダム化されますリンク、リン酸化部位のためのSH-3ドメイン、セリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジンのためのプロリン、またはプリンに。

[00120]候補薬剤は、核酸であることができます。核酸候補薬剤は、天然核酸、ランダム核酸、または「偏った」ランダム核酸を生じることができます。タンパク質について上述したように、例えば、原核生物または真核生物ゲノムの消化物を同様に使用することができます。

[00121]いくつかの実施形態では、スクリーニングと同定された候補薬剤は、本明細書に記載される方法に従って多能性細胞の生存、増殖および/または分化を調節するために、時によって、多能性細胞の生存、増殖および/または分化を増大させることができます少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、未処理対照に3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上の相対。いくつかの実施形態では、スクリーニングと同定された候補薬剤は、本明細書に記載される方法に従って多能性細胞の生存、増殖および/または分化を調節するために、少なくとも5％の多能性細胞の生存、増殖および/または分化を減少させることができます、好ましくは少なくとも10％> 20％> 30％> 40％> 50％、50％、70％、80％、90％、95％、最大97％、98％、99％以上、完全な還元（すなわち、ゼロの生存率、成長、増殖、または分化）未処理の対照と比較し含みます。

[00122]いくつかの態様において、候補薬剤は、それが投与される形態で直接機能します。あるいは、候補薬剤は、変更することができるか、または阻害剤または内の遺伝子発現またはタンパク質活性の活性化因子の産生をもたらす、例えば、所望の活性を調節する形態、細胞への核酸配列の導入およびその転写を生成するために細胞内で利用しますセル。

[00123]癌ワクチンの開発において、例えば、本明細書に記載の方法および組成物を使用することができると考えられます。本明細書に記載の（本明細書に記載の方法に従って成熟した腫瘍細胞を処理することによって）ようにして得られた多能性腫瘍細胞の少なくとも部分的に分化した子孫を生成することは、より強力なAPC（抗原提示の開発を可能にすることができる多様な変更抗原プロファイルを提供することができます細胞）癌ワクチンをベース。

[00124]いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、細胞の形質転換効率を増加させることに関する。細胞がより多くを含む遺伝子改変の方法を受け入れるが、導入遺伝子挿入、ウイルスベクター、および/またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼに限定されるものではない行うことができ、本明細書に記載のように多能性を誘導する、例えば、細胞ストレス。それは

細胞を可能にすることができる本明細書に記載される方法は、裸のDNAが得られた多能性細胞を形質転換するために使用することができるように遺伝的に受容状態に変更することが意図されます。 

[00125]本明細書に記載の技術のいくつかの態様は、細胞療法を必要とする被験体に、本明細書に記載の方法により製造多能性細胞、またはかかる細胞の少なくとも部分的に分化した子孫細胞を投与することを含む、細胞治療の方法に関する。いくつかの実施形態では、多能性細胞の治療的有効量または多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫が提供されます。いくつかの実施形態では、多能性細胞および/またはそれらの子孫は、自己由来です。いくつかの実施形態では、多能性細胞および/またはそれらの子孫は、同種異系です。いくつかの実施形態では、多能性細胞および/またはそれらの子孫は、自己由来です。いくつかの実施形態では、多能性細胞および/またはそれらの子孫は、HLA一致同種異系です。いくつかの実施形態では、多能性細胞および/またはそれらの子孫は同系です。いくつかの実施形態では、多能性細胞および/またはそれらの子孫は異種です。いくつかの実施形態では、細胞療法は、例えば、被験体からの細胞は、本明細書に記載される方法に従って多能性細胞を生成するために使用することができ、多能性細胞および/またはその多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫をすることができ、自己治療することができます被験体に投与されます。本明細書で使用される場合、「細胞療法を必要とする被験体」を有する、または有するか、または天然に存在する細胞または組織タイプの故障または天​​然に存在する多能性および/または関連する疾患を発症するリスクがあると診断された対象を意味します多能細胞（例えば幹細胞）。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、遺伝子疾患を治療するために使用することができる[00126]本明細書に記載のようにして得られた同種異系の多能性細胞および/またはそれらの子孫を投与することによって、例えば、例えばテイ - サックスまたは血友病。 

[00127]一態様では、本明細書に記載含む、被験体に投与される細胞療法と互換性のある細胞または組織の調製方法であって、方法に記載の細胞から多能性細胞（または複数の多能性細胞）を生成します細胞は、自己細胞またはHLAがマッチした同種異系細胞である、本明細書中に記載。いくつかの実施形態では、多能性細胞（または複数の多能性細胞）を被験体に細胞または組織を投与する前に、事前定義された細胞系統に沿って分化させることができます。

[00128]多能性細胞を、本明細書に記載の方法に従って生成された、例えば多能性幹細胞は、癌治療に使用することができます。例えば、高用量の化学療法+造血幹細胞移植は、骨髄の造血系は、本明細書に記載のように生成された多能性細胞の使用から利益を得ることができる再生します。

天然に存在する細胞または組織型または天然に存在する多能性および/または多能細胞の障害に関連する疾患の[00129]非限定的な例としては、再生不良性貧血、ファンコーニ貧血、及び発作性夜間血色素尿症（PNH）を含みます。他には、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、急性混合型白血病および急性未分化白血病などの急性白血病、。慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、若年性慢性骨髄性白血病（JCML）および若年性骨髄単球性白血病（JMML）を含む慢性白血病; 急性含む骨髄増殖性疾患、

骨髄線維症、血管新生骨髄様化生（骨髄線維症）、真性多血および本態性血小板血症; ムコ多糖症（MPS）を含むリソソーム蓄積症、ハーラー症候群（MPS-IH）、シャイエ症候群（MPS-IS）、ハンター症候群

（MPS-II）、サンフィリッポ症候群（MPS-III）、モルキオ症候群（MPS-IV）、マロトー-ラミー症候群（MPS-VI）、スライ症候群、β-グルクロニダーゼ欠損症（MPS-VII）、 

副腎白質ジストロフィー、ムコリピドーシスII（I-細胞病）、クラッベ病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ウォルマン病および異染性白質ジストロフィー; 家族赤血球貪食性のリンパ組織球、組織球症-Xと血球貪食を含む組織球性障害; チェディアック・東症候群、慢性肉芽腫症、好中球アクチン欠乏と網状発育不全などの食細胞障害; amegakaryocytosis /先天性血小板減少症を含む血小板の異常を、継承されました。多発性骨髄腫、形質細胞白血病、およびワルデンシュトレームなどの形質細胞障害、

マクログロブリン血症。幹細胞療法で治療可能な他の悪性腫瘍としては、とりわけ乳癌、ユーイング肉腫、神経芽腫および腎細胞癌が、これらに限定されません。また、幹細胞療法で治療可能である：COPDと気管支喘息などの肺障害; 毛細血管拡張性運動失調症、コストマン症候群、白血球接着欠損症、ディジョージ症候群、裸リンパ球症候群、オーメン症候群、重症複合免疫不全（SCID）、アデノシンデアミナーゼ欠損症SCID、T＆B細胞SCIDの非存在下、Tが存在しないことを含む、先天性免疫障害、細胞、正常なB細胞のSCID、共通の変数免疫不全およびX連鎖リンパ増殖性疾患; レッシュ・ナイハン症候群、軟骨毛髪形成不全、グランツマン血小板無力の血小板無力症、および大理石骨病を含む他の遺伝性疾患; 急性および慢性の脳卒中、外傷性脳損傷、脳性麻痺、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症およびてんかんを含む神経学的状態、。アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、および心筋梗塞を含む心疾患; 糖尿病を含む代謝障害; そして、眼障害は、黄斑変性症や視神経萎縮を含みます。このような疾患または障害は、いずれかによって治療することができます

多能性細胞の投与は、それ自体、所望の分化を促進する薬剤の投与を伴うまたは伴わない所望の細胞型にインビボで分化を可能に、及び/又はに分化多能性細胞を投与することによって、または少なくとも部分的に、in vitroで所望の細胞型に向かって分化。そのような状態を診断する方法は、当該技術分野における通常の技術の医師によく知られています。いくつかの実施形態において、被験体は、被験体は骨髄放射線治療によって切除された癌を有する対象とすることができる、例えば、細胞の集団を切除または幹細胞いる放射線療法または他の療法で処置したものとすることができます。

【00130】いくつかの実施形態では、多能性細胞を対象に投与されます。いくつかの実施形態では、少なくとも部分的に分化した細胞を被験体に投与されます。いくつかの実施形態では、細胞治療の方法は、さらに、前細胞を投与する事前定義された細胞系統に沿って分化多能性細胞を分化含むことができます。所望の細胞系統に沿って幹細胞を分化させる方法は、当該分野で公知であり、実施例は、本明細書に記載されています。

[00131]いくつかの実施形態では、多能性細胞を含む組成物は、本明細書に記載のまたは多能性細胞の子孫であり、少なくとも部分的に分化した細胞を被験体に投与される方法に従って得ました。 

[00132]いくつかの態様において、本明細書に記載の方法に従って得られる多能性細胞または多能性細胞の子孫であり、少なくとも部分的に分化した細胞を含む組成物は、必要に応じてさら​​に、G-CSF、GM-CSFおよび/または含むことができまたはM-CSFおよび/または有するか、または別個の組成物中のG-CSF、GM-CSFおよび/またはM-CSFを投与される被験体に投与することができます。G-CSF、GM-CSFおよび/またはM-CSFの投与は、例えば、良好な臓器再生および組織破片、廃棄物の蓄積の除去、炎症状態を誘導することができます。いくつかの実施形態では、[00133]、多能性細胞および/またはそれらの少なくとも部分的に分化した子孫は、本明細書に記載の方法に従って、培養中の多能性細胞の産生以下の比較的短い期間内に発生する可能性の投与（例えば、1、2、製造後5、10、24または48時間）。いくつかの実施形態では、少なくとも部分的に分化した子孫の投与が比較的短時間内に発生することができ、本明細書に記載の方法に従って、培養中の多能性細胞の分化の後（例えば、1、2、5、10、24または48時間後に製造）。いくつかの実施形態では、多能性細胞および/またはそれらの少なくとも部分的に分化した子孫は、極低温の投与の前に保存することができます。

いくつかの態様では[0134]本明細書に記載の技術は、本明細書に記載の方法および/または多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫に応じて生成された多能性細胞を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物および/または多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫、および必要に応じて薬学的に許容される担体本明細書に記載の方法に従って生成された多能性細胞を含みます。組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含むことができます。

[00135]医薬組成物は適切な賦形剤、または安定剤を含むことができ、そして、例えば、溶液、懸濁液、ゲル、またはエマルジョンであり得ます。典型的には、組成物は、一緒に担体と、細胞の約5〜95％から、好ましくは、約0.01〜99％で含有します。薬学的または生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と組み合わせた細胞は、移植によって、または注射によって、皮下、非経口的に投与することができます。ほとんどの治療目的のために、細胞は、液状の溶液または懸濁液として注射によって投与することができます。用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書に記載の方法および/または多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫に応じて生成された多能性細胞の投与のための担体を指します。そのような担体は、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されません。各キャリアは、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容可能」でなければならない、例えばキャリアは、被験者に対する薬剤の影響を減少させません。言い換えれば、キャリアは、薬学的に不活性であり、生細胞と適合性です。

[00136]適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質および意図されるレシピエントの体液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の滅菌注射溶液が挙げられます。水性および非水性滅菌懸濁液は懸濁剤および増粘剤を含むことができます。製剤は、単位用量または多用量容器で提示することができます。

非経口剤形[00137]例としては、注射、注射用懸濁液、およびエマルジョンのための準備ソリューションが、これらに限定されません。非経口剤形は、本明細書に記載される方法および/または多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫に応じて生成された多能性細胞を保持するための生体吸収性足場材料を使用して、例えば、製造することができます。

[00138]用語「エピジェ​​ネティック修飾は、「ゲノムのマーキング化学物質を指します。

エピジェネティックマークは、DNAメチル化（インプリント）ならびに履歴などのDN Aに関連するタンパク質のメチル化やアセチル化を含めることができます。親の原点-仕C遺伝子の発現（いずれか母方か父方の染色体から）多くの場合、哺乳動物で観察され、エピジェネティックな修飾に起因しているされています。親の生殖系列では、エピジェネティックな修飾は、安定した遺伝子サイレンシングまたは活性化につながることができます。

本明細書中で使用される[0139]用語「投与する」または「移植」は、所望の部位での細胞の少なくとも部分的な局在化を生じる方法または経路によって、被験体への細胞の配置を意味する所望の効果があるよう生産。 

[00140]本明細書に記載の多能性幹細胞、および/またはそれらの少なくとも部分的に分化した子孫細胞は、任意の方法で投与することができるが、臨床医が適切な発見し、例えば細胞又は懸濁液の注射などによって局所投与​​を含むことができます移植可能な足場または支持体上または内に堆積または成長させた細胞の調製の注入によって。移植可能な足場は、とりわけ、分解性又は吸収性ポリマーのうちのいずれか、または、例えば、絹骨格を含むことができます。本明細書に記載の多能性幹細胞を含む医薬組成物、および/またはそれらの少なくとも部分的に分化した子孫の投与に適した経路としては、局所投与、例えば、腹腔内、非経口、腔内、または皮下投与に限定されません。フレーズ

本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口投与」、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、腹腔内、皮内、皮下注射および注入することなく、含みます。 

投与は、針、カテーテルおよび注射、または外科的移植に適した注射器の使用を含むことができます。送達手段および送達部位の組合せの使用は、所望の臨床効果を達成するために意図されています。

[00141]用語「エピジェ​​ネティック修飾は、「ゲノムのマーキング化学物質を指します、

エピジェネティックマークは、DNAメチル化（インプリント）ならびにヒストンなどのDNA、に関連するタンパク質のメチル化やアセチル化を含めることができます。親の原点特異的遺伝子発現（いずれか母方か父方の染色体から）多くの場合、哺乳動物で観察され、エピジェネティックな修飾に起因しているされています。親gemilinesでは、エピジェネティックな修飾は、安定した遺伝子サイレンシングまたは活性化につながることができます。

[0142]一実施形態では、多能性幹細胞の治療有効量は、本明細書に記載の、および/またはそれらの少なくとも部分的に分化した子孫を被験体に投与されます。「治療有効量」は、治療される状態の症状またはマーカーで測定可能な改善を生じるのに十分な、本明細書に記載の多能性幹細胞の量、および/またはそれらの少なくとも部分的に分化した子孫です。特定の対象に対する所望の治療応答を達成するの​​に有効である細胞の量を投与するために治療用組成物中の細胞の実際の用量レベルを変化させることができます。選択される用量レベルは、これらに限定され、治療用組成物、製剤、投与経路、他の薬剤または治療と組み合わせて、処置される状態の重症度、の物理的状態の活性、年齢、ませんが件名、以前の医療処置される対象の歴史と治療を施す臨床医または開業医の経験および判断。一般に、スケジュールされた用量および投与は遅く、好ましくは症状の進行を抑制し、また、好ましくは、1つ以上の症状または状態のマーカーの減少を引き起こすことをもたらすのに十分であるべきです。決意と治療上有効な用量の調整、ならびにこのような調整を行うタイミングと方法の評価は、医学の当業者によく知られています。

【0143】多能性幹細胞の投与量は、本明細書に記載の、および/ ​​またはそれらの少なくとも部分的に分化した子孫は、治療の観察される効果に合わせて、必要に応じて、医師によって決定され、調整することができ、本明細書に記載の方法に従って投与されます。熟練した臨床医は治療が治療上の利益を提供している時を決定するために、被験体をモニターするために、細胞の別の用量を投与するかどうかを決定するために、増加または用量、中止処理、レジュームを減少するための持続時間、治療の頻度に関しては、一般的です治療、または治療計画に他の変更を行います。投与された細胞が生着し、中長期のために生き残ることが予想される場合、投与量は必要になることが繰り返されます。しかし、投与は必要に応じて繰り返すことができるとしては、被験体が耐え。投与量は、実質的な有害な副作用を引き起こすほど大きいものであってはなりません。投与量はまた、任意の合併症の事象において個々の医師によって調整することができます。しかしながら、典型的には、投与量は、100×10 1の範囲とすることができる⁹、例えば、100〜10,000細胞、1,000〜100,000個の細胞10,000〜1,000,000の細胞を本明細書に記載のように多能性幹細胞、および/ ​​または成人のためのそれらの少なくとも部分的に分化した子孫、または1,000,000×10へ1 ⁹細胞。有効用量は、動物モデル試験バイオアッセイ又はシステム、例えば、由来する用量応答曲線から外挿することができます。

[00144]本明細書に記載の多能性幹細胞を含む治療用組成物、および/または本明細書に記載のように調製し、それらの少なくとも部分的に分化した子孫は、任意に、SCIDマウスのような1つまたはインビトロおよび/または疾患のインビボ動物モデルにおいてより適切で試験モデル、有効性を確認するために、当該分野で周知の方法に従って、移植細胞のインビボ増殖に評価し、用量を推定します。具体的には、投与量は、最初の活性、安定性または治療の対の他の適切な手段によって決定することができます

関連するアッセイで、非治療（例えば、未処理の動物モデル対処理されたとの比較）。本明細書に記載の多能性幹細胞の有効量、および/またはそれらの少なくとも部分的に分化した子孫を決定する際に、医師は、他の基準の中で、移植された細胞および処置される状態の進行の成長および容積を評価します。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変化することができます。

[00145]本明細書に記載の治療方法に関しては、多能性幹細胞の投与は、本明細書に記載されるものではない、及び/又はそれらの少なくとも部分的に分化した子孫は、特定の投与様式、用量、または投与頻度に限定されます。投与のすべてのモードは、筋肉内、静脈内、腹腔内、膀胱内、関節内、病巣内、皮下、または処置される状態を治療するのに十分な用量を提供するのに十分な任意の他の経路を含む、意図されます。

[00146]いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、インビボでの多能性細胞を生成するために使用することができ、その結果は、多能性表現型を獲得し、本明細書に記載されるように、被験体中に存在する、例えば、細胞がストレスを受けることができます。例えば、温和な酸溶液を注入および/または直接アプリケーションを介して組織に導入することができ、インビボで細胞に本明細書に記載の応力を印加する方法は、容易に明らかであり、温度が周囲の組織を加熱または冷却することができるプローブによって、または介して変更することができます非侵襲的な方法、例えば、フォーカスビーム放射を使用します。多能性のインビボでの調節は、例えば、組織再生又は創傷治癒を増大させるために使用することができます。非限定的な例としては、多能性表現型を仮定して、新しい組織を生成するために、膝関節細胞（例えば、滑膜や軟骨細胞）を誘導する関節炎膝関節に軽度の酸の注入を含むことができます。さらなる非限定的な例は、脳卒中または中枢神経系の損傷（例えば、脊髄損傷）を有する被験体の治療を含むことができます。炎症が解決した後に、本明細書に記載されるように、損傷した領域に隣接するセルは、損傷組織の再増殖および/または損傷した組織を再生または修復することができる多能性細胞を発生させる、ストレスで処理することができます。[00147]さらなる非限定的な例では、（デメチラーゼでの処理による）エピジェネティックな状態の変化は、非インスリン分泌細胞（膵臓の例えばアルファglugagon細胞）は、インスリン分泌細胞に変換させることができる（例えばベータ細胞）。したがって、本明細書に記載の方法に従って非インスリン分泌細胞（膵臓の例えばアルファglugagon細胞）を処理してインスリン分泌細胞になる細胞をもたらすことができる、例えば、Aベータ細胞のような、いずれかのin vivoでまたはin試験管。

[00148]また、非多能性細胞、成熟細胞、悪性細胞、例えば、細胞は、本明細書に記載の方法に従って処理されていない、本明細書に記載の多能性細胞が他の細胞（すなわち、「レシピエント細胞」）と融合することができることが企図され、そして/または損傷した細胞。融合の前と比較して、細胞の融合は、レシピエント細胞における細胞の修復酵素の発現および/または活性のレベルの増大をもたらすことができます。これは細胞の損傷、突然変異、および/またはレシピエント細胞のエピジェネティック状態の変更の修復を増加させることによって、例えば、レシピエント細胞の健康および/または機能を増大させることができます。

[00149]いくつかの実施形態では、インビボでの細胞の多能性を増加させることにより、これらの細胞のエピジェネティックマーカー（例えばDNAメチル化、脱メチル化、および/またはヒドロキシメチル化状態）を調節することができます。エピジェネティックマーカーの調節は、に関与している例えば、悪性腫瘍、関節炎、自己免疫疾患、老化、などなどの治療

本明細書に記載の方法に従って、後成的に結合条件が企図されます。 

[00150]いくつかの実施形態では、複数の組織を同時にin vivoで処理することができる、例えば、弱酸性の状態は、複数の臓器に誘導することができ、例えば、連続的にまたは同期して

広範囲の損傷又は老化を治療するための（例えば、脳、心臓、肝臓、肺、および/または甲状腺）。 

[00151]また、本明細書にさらに記載されるように、細胞のin vivoでの治療は、多能性細胞および/または本明細書に記載のように製造されたそれらは、少なくとも部分的に分化した子孫の投与と組み合わせることができることが企図されます。 

[00152]本明細書に記載される方法は、子宮内の胎児または胚例えば、治療するために使用され得ることが本明細書中で企図されます。 

[00153]治療の効力は、本明細書に記載のまたは任意の他の測定可能なパラメータを適宜のマーカー、標識、症状または発生率を測定することによって、例えば、条件は、多能性細胞の子孫の、例えば数処置される、評価することができます。このようなパラメータのいずれか、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することによって、治療または予防の有効性をモニターするために、当該技術分野における当業者の能力の範囲内です。

そこに1つ以上のマーカー、指標、または状態の症状の統計学的に有意な改善があり、治療されている、または悪化するか、他の方法で予想される症状を発症する障害によってとき[00154]効果的な治療が明らかです。例として、条件の測定可能なパラメーターにおいて少なくとも約10％の、有利な変化、好ましくは少なくとも約20％> 30％> 40％> 50％>以上を示すことができます効果的な治療。方法に従って生成された多能性細胞のための有効性は、本明細書に記載および/または多能性細胞の少なくとも部分的に分化した子孫はまた、本明細書に記載の状態のために、当技術分野で知られている実験動物モデルを用いて判定することができます。実験動物モデルを使用する場合は、マーカーの統計的に有意な変化が観察された場合、治療の有効性が証明され、例えば、本明細書に記載のように多能性細胞と骨髄切除および処置後のマウス中に存在する造血細胞の数。

本明細書に記載の[00155]一態様では、胎盤細胞に分化可能な多能性細胞、FGF4の存在下で、本明細書に記載の方法に従って得られる多能性細胞を培養することを含む方法で製造する方法です。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、胚性幹細胞に分化することが可能です。いくつかの実施形態では、FGF4の濃度は、約1μMのに約1nMです。いくつかの実施形態では、FGF4の濃度は1μMのに1nMのです。いくつかの実施形態では、FGF4の濃度は、約5nm〜約500nmです。いくつかの実施形態では、FGF4の濃度は、約10nMから約100nMです。

いくつかの態様では[0156]本明細書に記載の技術は、細胞の細胞質および/またはミトコンドリアの一部を除去することからなる、細胞から多能性細胞を生成するためのシステムに関する。 

[00157]本明細書に記載の方法に従って、細胞をストレスに供された容器を含むことができ、細胞から多能性細胞を生成するためのシステム。細胞は、本明細書に記載の方法に従って、細胞質および/またはミトコンドリアの量を低減するために低酸素条件下日間培養以上である場合、コンテナは、例えばように、体細胞および/または多能性細胞の培養のために適切であり得ます。あるいは、容器は、細胞を強調するのに適した、はなく例として、細胞を培養することができ、細胞は限られた期間、例えば、1時間未満のための狭い開口部を有する装置で粉砕されている場合。容器は、例えば、血管、管、マイクロ流体装置、ピペット、バイオリアクター、または細胞培養皿であることができます。容器は、体細胞および/または多能性細胞の培養に適した条件を提供する環境に維持することができる（例えば、

インキュベータ内）または低酸素含有量の環境を提供するインキュベーター）内に含まれる細胞（例えば上の環境ストレスの原因となる条件を提供する環境に含まれています。容器は、例えば、1ストレス、2応力、3ストレス、またはそれ以上の、本明細書で上述した環境ストレスの1以上を提供するように構成することができます。操作のために適切なおよび/または体細胞および/または多能性細胞を培養容器は、当業者に公知であり、市販されている（例えば、カタログ番号

CLS430597シグマアルドリッチ; セントルイス、MO）。いくつかの実施形態では、容器は、マイクロ流体デバイスです。いくつかの実施形態では、容器は、細胞培養皿、フラスコ、またはプレートです。

[0158]いくつかの実施形態では、システムは、さらに、例えば、多能性細胞を選択するための手段を備えることができる多能性マーカー（例えば、あるOct4-GFP）を発現する細胞を選択するか、または本明細書に上述したように大きさを選択することができるFACSシステムを含むことができるシステム。BD LSRII™およびBD Biosciences社によって製造さBD FACSDIVA™ソフトウェア（カタログ番号643629）に結合された細胞の選択のための方法および装置、当業者に公知であり、市販されている、例えば、BD FACSARIA SORPは™。フランクリンレイクス、ニュージャージー州。

[00159]いくつかの実施形態では、組織内に存在しない細胞をシステムに提供されます。いくつかの実施形態では、組織は、システムに提供され、システムはさらに、細胞の1種類以上を単離する手段を備えます。非限定的な例として、システムは、組織ホモジナイザーを含むことができます。組織ホモジナイザーおよびそれらの使用方法は、当技術分野で知られており（例えばFASTH21™、カタログ番号21から82041オムニ・インターナショナル、ケネソー、GA）市販されています。あるいは、システムは、血液または体液のサンプルを処理するために遠心分離を含むことができます。

いくつかの実施形態では[0160]、システムを自動化することができます。細胞分離、細胞培養、及び選択装置を自動化する方法は、当技術分野で公知であり、市販されています。例えば、FASTH21™組織ホモジナイザー（カタログ番号21から82041オムニインターナショナル、ケネソー、ジョージア州）とBD FACSARIA SORP™。

[00161]いくつかの実施形態では、システムは、無菌環境で動作することができ、またはシステムは閉じた無菌の系として動作させることができ、例えば、滅菌することができます。 

本明細書に記載の[00162]一態様では、多能性細胞の自己再生能力を増加させる方法、の存在下で細胞を培養することを含む方法であります 

副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、2Iまたは3I媒体。本明細書で使用される場合、「自己複製能」とは、例えば、通路の数、細胞の細胞を培養し、インビトロで継代することができる時間の長さを指し、それは子孫を受け、生細胞を産生し続けることができます。本明細書に記載される方法に応じて増加自己複製能を持たせているセルは、例えば、全能性細胞および/または本明細書の他の箇所に記載されるように、ストレスに暴露することによって生成された細胞であってもよいです。

[00163]いくつかの実施形態では、ACTHの存在下で培養すると、約0.1μΜから約10μΜに、約100μΜ約0.1μΜから約1,000μΜ、例えば約0.1μΜで含む細胞培地中で細胞を培養することを含むことができ、または約10μΜ。いくつかの実施形態では、ACTHの存在下で細胞を培養すると、ACTHを含むLIF培地中で細胞を培養することを含むことができます。メディア（例えばCatNos ESG1107 Millipore社から購入することができ、LIF、LIF、ACTH、2Iおよび3Iは、商業的に入手可能であり、当技術分野で周知であり、例えば、ACTHは、Sigma-Aldrich社（セントルイス、MOカタログ番号A0673）から購入することができます;ニューアーク、カリフォルニア州）;ビレリカ、MA）、および3iが幹細胞株（例えば、カタログ番号SCS-SF-ES-01、iSTEMは、細胞培養培地幹」などから購入することができます。

[00164]いくつかの実施形態では、培養工程は、少なくとも3日間、例えば、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、またはそれ以上を進めることができます。培養工程の後に、細胞を、本明細書の他の箇所に記載のように多能性細胞を維持するのに適した条件下で維持することができます。

[0165]いくつかの実施形態では、培養工程の後に、細胞は、幹細胞マーカーの検出および/または増加したレベルを発現することができます。細胞マーカー、それらを本明細書の他の箇所に記載されて検出する方法を幹。いくつかの実施形態では、幹細胞マーカーのOct3 / 4からなる群から選択することができます。Nanog; Rexl; KLF; Sox2の; KLF2; Esrr-β; TBX3; そして、KLF5。

[00166]本開示の実施形態の説明は、網羅的であることまたは開示された厳密な形態に本開示を限定するものではありません。特定の実施形態との例が、本開示は例示の目的のために本明細書に記載されているが、種々の等価な改変が、当業者は認識するであろうように、本開示の範囲内で可能です。方法のステップまたは機能は、所与の順序で提示されている間、例えば、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実行することができる、または機能が実質的に同時に行われてもよいです。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができます。本明細書に記載の様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができます。本開示の態様は、必要に応じて、変更することができ、本開示のさらなる実施形態を提供するために、上記の参考文献及び出願の組成物、機能および概念を採用します。これらおよび他の変更は、詳細な説明に照らして、本開示に対してなされ得ます。

上記実施形態のいずれかの[00167]特定の要素を組み合わせ、または、他の実施形態の要素の代わりに用いることができます。本開示の特定の実施形態に関連する利点は、これらの実施形態の文脈で説明してきたが、さらに、他の実施形態はまた、そのような利点を示すことができ、すべての実施形態は、本開示の範囲内にそのような利点を示す必ずしも必要ではありません。[00168]同定したすべての特許および他の刊行物は、明白に、例えば、そのような刊行物に記載された方法は、本発明に関連して使用されるかもしれないこと、記載および開示する目的で参照により本明細書に組み込まれます。これらの刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供されます。この点では何も発明が先行発明によって、またはその他の理由で、そのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではありません。これらの文書の内容として、日付や表現についてのすべての記述は、申請者が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認を構成するものではありません。

[00169]本発明は、さらに限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例により例示されます。 

本明細書に記載された技術の[00170]いくつかの実施形態は、以下の番号のいずれかの段落に応じて定義することができます。 

1の方法は、ストレスに細胞を供することからなる、多能性細胞を生成します。 

2.多能性細胞は、外因性遺伝子、転写物、タンパク質、核成分または細胞質、または細胞融合無しの導入なしに生成される、請求項1に記載の方法。 

3.さらに、多能性を示す細胞を選択することを含む項1~2のいずれかに記載の方法は、。 

前記細胞は組織の一部として存在していない、請求項1~3のいずれかに記載の方法。

前記細胞が体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞である、請求項1~4のいずれかに記載の方法。 

前記細胞が単離された細胞である、請求項1~5のいずれかに記載の方法。 

細胞は、細胞の不均一な集団で存在する、請求項1~6のいずれかに記載の方法、7。 

細胞は、細胞の均質な集団で存在する、請求項1~7のいずれかに記載の方法、8。 

前記パラグラフ1-8のいずれかの方法、多能性を示す細胞を選択する前記幹細胞マーカーを発現する細胞を選択することを含みます。 

10.幹細胞マーカーは、以下からなる群から選択される、請求項9のいずれかに記載の方法。 

Oct4; Nanog; E-カドヘリン、およびSSEA4。段落1-10のいずれかに記載の方法において、前記多能性を示す細胞を選択することは、接着ない細胞を選択することを含みます。

ストレスは、組織または細胞培養物中でunphysio論理的ストレスを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。 

極端な温度への外傷、機械的刺激、化学的暴露、超音波刺激、酸素欠乏、放射線、露光、解離：ストレスから選択される少なくとも一つの環境刺激に対する細胞の曝露を含む、請求項1~12のいずれかに記載の方法であって、 、粉砕、肉体的ストレス、高浸透圧、hypoosmosis、膜損傷、毒素、極端なイオン濃度、活性酸素、紫外線曝露、強い可視光、本質的な栄養の欠乏、またはunphysiolosically酸性環境。 

応力は、約3.0から約6.8までからのpHに細胞をさらすことを含む、請求項1-13のいずれかに記載の方法。 

応力は、約4.5から約6.0までからのpHに細胞をさらすことを含む、請求項1~14のいずれかに記載の方法。 

応力は約5.4〜約5.8からのpHに細胞をさらすことを含む、請求項15に記載の方法。 

細胞を2~3日間露出している、請求項12〜16のいずれかに記載の方法。細胞は1日以下で露出している、パラグラフ12-17のいずれかに記載の方法。細胞が1時間以下で露出している、パラグラフ12-18のいずれかに記載の方法。細胞が約30分間露出される、請求項12〜19のいずれかに記載の方法。

極端な温度への曝露は、C 35℃以下または42℃以上の温度に細胞をさらすことを含む、請求項13に記載の方法。 

段落21の方法は、前記極端な温度への曝露は、、または凍結または少なくとも約85℃の温度への細胞の暴露以下の温度に細胞をさらすことを含みます。 

機械的刺激は、ストレスおよび/または高圧を剪断するために細胞を曝露することを含む、請求項13に記載の方法。 

機械的刺激は、細胞のサイズよりも小さい開口部を有する少なくとも1つのデバイスを介して細胞を通過させることを含む、請求項23に記載の方法。 

段落23の方法は、前記機械的刺激は、徐々に小さく開口を有する複数のデバイスを介してセルを通過含みます。パラグラフ1〜25のいずれかに記載の方法は、さらに、多能性細胞の増殖を可能にするために、多能性細胞を培養することを含みます。

多能性細胞は、幹細胞マーカーを発現する、請求項1〜26のいずれかに記載の方法。 

幹細胞マーカーは、以下からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。 

Oct4; Nanog; E-カドヘリン、およびSSEA4。

細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜28のいずれかに記載の方法。 

細胞がヒト細胞である、請求項1-29のいずれかに記載の方法。 

細胞は、成人細胞、新生児細胞、胎児細胞、羊膜細胞、または臍帯血細胞である、請求項1-30のいずれかに記載の方法。 

段落1-31のいずれかに記載の方法は、さらに、インビトロで多能性細胞を維持することからなります。 

細胞のエピジェネティックな状態をより厳密に胚性幹細胞のエピジェネティックな状態に類似するように改変されている、パラグラフ1-32のいずれかに記載の方法。 

エピジェネティックな状態は、メチル化パターンを含む、請求項33に記載の方法。 

ストレスは、細胞から細胞質の少なくとも約40％を除去することを含む、請求項1-34のいずれかに記載の方法。 

質の少なくとも約50％が細胞から除去される、請求項35に記載の方法。 

質の少なくとも約60％が細胞から除去される、請求項36に記載の方法。 

細胞質の段落37、請求項60〜80％の間）の方法は、細胞から除去されます。 

質の少なくとも約80％が細胞から除去される、請求項37に記載の方法。 

質の少なくとも約90％が細胞から除去される、請求項39に記載の方法。 

ストレスは、細胞からのミトコンドリアの少なくとも約40％を除去することを含む、請求項1〜40のいずれかに記載の方法。 

細胞質の部分の除去は、細胞質から少なくともミトコンドリアの約50％を除去する、請求項41に記載の方法。細胞質またはミトコンドリアの除去が細胞質からミトコンドリアの約50％-90％を除去する、請求項42の方法。

細胞質またはミトコンドリアの除去が細胞質からミトコンドリアの90％以上を除去する、請求項42の方法。 

応力が応力に曝露された細胞の少なくとも10％の細胞膜を破壊するのに十分である、請求項1-44のいずれかに記載の方法。 

含むアッセイ; 

段落候補薬剤と1 to45のいずれかに記載の方法により製造さ多能性細胞を接触させます。 

生存性の一つ以上に影響を与える薬剤、分化、多能性細胞の増殖を識別するために使用するためのパラグラフ46のアッセイ。 

対象に対する細胞治療の方法で45段落1のいずれかに記載の方法により製造多能性細胞の使用。 

細胞治療と互換性のある細胞または組織を調製する方法を含む、被験体に投与されます。 

段落1のいずれかに記載の細胞から多能性細胞を生成します

45; 

前記細胞は、自己細胞またはHLA適合同種異系細胞です。 

段落49の方法は、さらに前の被験体への細胞または組織に投与することを事前に定義された細胞系統に沿って分化多能性細胞を分化含みます。多能性細胞は、1〜45項のいずれかに記載の方法によって細胞から生成された多能性細胞を含む組成物。

多能性幹細胞を作製する方法、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）の存在下で細胞を培養することを含む方法、2Iまたは3I培地 

細胞は、ACTHを含むLIF培地で培養される、請求項52に記載の方法。 

ACTHは、約100μΜ約0.1μΜからの濃度で存在する、請求項52または53に記載の方法。 

細胞は、段落1〜45のいずれかに記載の方法により生成される細胞である、請求項52-54のいずれかに記載の方法。 

細胞は全能性細胞である、請求項52-55のいずれかに記載の方法。 

細胞は、少なくとも3日間、ACTH、2Iまたは3I培地の存在下で培養される、請求項52〜56のいずれかに記載の方法。 

細胞は、少なくとも5日間、ACTH、2Iまたは3I培地の存在下で培養される、請求項52-57のいずれかに記載の方法。 

細胞は、少なくとも7日間、ACTH、21または3I培地の存在下で培養される、請求項52〜58のいずれかに記載の方法。60.培養工程の後に、細胞は、以下からなる群から選択された幹細胞マーカーの検出可能なレベルを発現する、請求項52-59のいずれかに記載の方法。

Oct3 / 4。Nanog; Rexl; Klf4の; Sox2の; KL£2。ESRR-β; TBX3; そして、KLF5。

61多能性細胞の自己再生能力、方法を増大させる方法 

副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、2Iまたは3I培地の存在下で細胞を培養することを含みます。 

細胞は、ACTHを含むLIF培地で培養される、請求項62 61の方法。 

63 ACTHがで存在する、パラグラフ61-62のいずれかの方法で、 

約100μΜ約0.1μΜからの濃度。 

64細胞​​は、段落1〜45のいずれかに記載の方法により生成される細胞である、請求項61〜63のいずれかに記載の方法。 

65細胞は全能性細胞である、請求項61-64のいずれかに記載の方法。 

66細胞は、少なくとも3日間、ACTH、2Iまたは3I培地の存在下で培養される、請求項61〜65のいずれかに記載の方法。 

67細胞は、少なくとも5日間、ACTH、2Iまたは3I培地の存在下で培養される、請求項61-66のいずれかに記載の方法。 

68細胞は、少なくとも7日間、ACTH、2Iまたは3I培地の存在下で培養される、請求項61-67のいずれかに記載の方法。 

69.培養工程の後に、細胞は、以下からなる群から選択された幹細胞マーカーの検出可能なレベルを発現する、請求項61-68のいずれかに記載の方法。 

Oct3 / 4。Nanog; Rexl; Klf4の; Sox2の; KLF2; ESRR-β; TBX3; そして、KLF5。

70は、細胞療法を必要とする対象における自己細胞療法を含む方法。細胞が被験体から得られる、請求項1〜45のいずれかに記載の細胞から多能性細胞を生成し、そして

B。多能性細胞または被験体へのそれらの分化した子孫細胞を含む組成物を投与します。

段落70の方法71は、さらに前の被験体に組成物を投与する事前定義された細胞系統に沿って分化多能性細胞を分化含みます。

72胎盤細胞に分化することができる多能性細胞を産生する方法、FGF4の存在下での段落1-45のいずれかの方法で生成された多能性細胞を培養することを含む方法。 

FGF4の濃度が1μMの1 nmである、請求項73 72の方法。

74.多能性細胞がすることが可能である、請求項72または73の方法、 

胚性幹細胞に分化します。 

（実施例1） 

[00171]すべての生物は原始的な生存本能を持っています。植物が重要な外部応力を受けるときには、その原因を生き残るためのメカニズムを活性化します

細胞の脱分化とは、損傷領域または生物全体の再生を可能にします。そのようなメカニズムは、下等生物は極端な環境変化を生き残るために不可欠であるように思われるが、それらは、哺乳動物における文書化するには至っていません。

[00172]本発明者らは、物理的なストレスが成熟した哺乳動物細胞は、植物と下等生物に見られるものと類似した幹細胞の状態に戻すことが生じる可能性があることを仮定しました。この仮説を調べるために、7成体の体細胞組織から調達した成熟細胞を研究しました。物理的ストレスが少ない成熟した状態に戻すには、成熟細胞を変化させるのに最も効果的であるかもしれない上に第1焦点に、Oct4の-GFPマウスから採取したCD45陽性リンパ球を検討しました。幹細胞の特定のOct4プロモーターが活性化されたとき、これらのマウスからの細胞は、幹細胞表現型への復帰の読み出しを提供します。成熟した、完全に分化した細胞は、いくつかの重要な外部刺激に曝露しました。

[00173]例えば、CD45陽性リンパ球は、強い化学的応力を提供するために、低pHの溶液に曝露しました。曝露の3日以内に、GFPを発現する細胞が観察され、5日以内に、GFPを発現する細胞からなる球状のコロニーが観察されました。このようにして生成された細胞は、ストレス改変された幹細胞（SASCsかのSAC）として、実施例で言及されています。SACはまた、若返っ幹細胞（のRSC）または動物カルス細胞（ACCS）と呼ぶことができます。SACは、通常、胚性幹細胞に関連するいくつかのマーカーを発現しました。SACのは、ES細胞への分化能と同等を示したキメラマウスの作製に貢献し、4N胚盤胞に注入された場合、全体の胎児を生成することができました。このようにして生成された細胞は、最初は低いミトコンドリア活性を示し、正常細胞に基づく傷害防御機構の誘導に関連する他の状態。そして、彼らはOct4およびNanogの遺伝子プロモーターの脱メチル化を示しました。ストレス変化した細胞の再プログラミングは、間葉上皮移行を介して誘導されると思われました。知見は、損傷（外部刺激）に応答して、植物カルスに含まれる細胞の説明と一致しています。植物カルスは、クローン体を形成することができる多能性植物の幹細胞への細胞のストレス誘発性の変換から形成されています。有意な外部刺激に応答して成熟した完全に分化した体細胞、哺乳動物細胞から生成されたこのような球状コロニーを、「動物カルス細胞」（として、例えば、コロニー又はカルスに含まれる応力変化した細胞を動物のカルスと呼ぶ、とされていますACCS）またはのSAC。[00174]は、このように、重要な物理的・化学的ストレスは、通常の成熟した大人の細胞は胚形成が可能な多能性幹細胞に再プログラムされる原因となりました。理論に束縛されるものではないが、再プログラミングのメカニズムは、通常、損傷に応答して見られる細胞生存および修復プロセスの誘導を含むように思われます。かなりのストレス外部刺激に応答して再プログラム状態に戻すために、哺乳動物細胞、植物のものと非常に類似の生存メカニズムを有することが本明細書に示されています。

[00175]細胞の様々なタイプの報告によると、誘導または特定の遺伝子の強制発現により多能性幹細胞状態に再プログラミングされた^{1 5}。それはまた、火傷、化学的損傷として、刺激物への曝露の結果として、細胞へのダメージを考えられています、外傷および放射線は、正常細胞が癌細胞になるように変更してもよいです。

[00176]はじめに 

[00177]すべての生物は環境に自分自身を適応し、自分の体を再生することによりストレス刺激に関連した傷害を生き残るためには、共通の本能を持っているように見えます。植物では、個体発生は、接合体ではなく、また、完全に分化した細胞および未成熟花粉だけでなく観察されます。脊椎動物では、イモリは手足を含むいくつかの解剖学的構造や臓器、再生することが可能である¹。特に注目すべきは、植物やイモリの両方によって実証著しい再生能力が以前に完全に分化した体細胞の細胞脱分化を引き起こす外部刺激によって誘導されることです。数十億年は人生の最も初期の形態から渡されており、異なる生物が独自の方法で進化してきたが、この生存本能は、現代の時代の生物に共通の祖先から継承することができます。最終分化哺乳類の細胞が正常に分化過程を逆にできないことが考えられているが、哺乳類は急激な環境変化に対応して死を逃れるために、以前に正しく評価されていないプログラムを保持することができます。

[00178]植物カルス、植物ホルモンによって培養中に刺激することができるような創傷などの外部刺激、に応答して形成された細胞を増殖さの塊。カルスは、クローン体全体を再生することが可能である各々がカルス細胞と呼ばれる体細胞を再プログラム含ま。カルス細胞は、植物に固有ではなく、外部の刺激に応答して体細胞から生成されます。最近の研究は、哺乳類体細胞は、遺伝子誘導3-外因性プロセスによって再プログラムすることができることを実証したが^、「植物に匹敵するように、外部の物理的、又は化学的刺激に応答して7、哺乳類体細胞の再プログラミング、報告されていません興味深いことに、火傷、化学的損傷、外傷および放射線などのような刺激物への暴露のような極端な外部刺激が、癌細胞になるように、正常な体細胞を変化させることができると考えられる。このような経験は、外部刺激は、哺乳動物細胞をもたらすことを示すように思われます変化する。

[00179]本研究では、哺乳動物細胞は、植物と同様に、重要な外部応力への暴露を生き残るための機構を保持することが仮定されました。このレポートには、重要な物理的、化学的刺激のアプリケーションは様々な組織から調達成熟した、完全に分化した哺乳動物の体細胞の再プログラミングを、引き起こす可能性があり、そのようなストレスに改変された細胞」は、動物のカルス細胞」を含む動物のカルスを形成することが可能であるという証拠を提示しますクローン体を再生成することができます。

[00180]結果 

[00181]重要な物理的および化学的刺激は、体細胞を成熟するために適用しました。

胚性転写因子Oct4のは、細胞の多能性状態の調節に重要であると考えられているので、初期の戦略は、外部からの刺激が最も効率的にOct4発現再プログラムさになるように成熟した細胞を改変されたかを識別することでした。CD45陽性造血系統細胞は、最初の混入を避けるために研究されました

未分化細胞。Oct4-GFPから調達脾臓から採取したCD45陽性細胞

Q 

（GOF）マウスは、様々な重要な物理的および化学的刺激に曝露しました。エクスポージャーが含まれる：ストレプトリジンOを使用して、浸透圧処理、かなりの機械的摩砕による治療、低pHへの曝露、細胞膜の損傷の適用を

2__|_ 

（SLO）、低酸素症および高Ca濃度に栄養と暴露下への暴露。次に、GFPを発現する細胞を同定ソートおよびFACSを用いて収集しました。Oct4の遺伝子発現をRT-PCRにより確認しました。適用される刺激のそれぞれへの曝露は、ある程度（図5A）にGFPを発現する成熟細胞の再プログラミングを生じました。低pHの化学的ストレス、重要な機械的摩砕の物理的ストレスに成熟細胞の曝露は、Oct4発現成熟細胞を変化させるのに最も効果的な治療法であると思われました。Oct4の発現細胞への変換を誘導するための最適pHを決定するために、CD45陽性細胞は、pH 6.8にpHを4.0から、様々な酸性度の溶液に曝露しました。酸性溶液への曝露後3日目に、細胞のGFP発現は、FACSを用いて分析しました。pHを有する酸性溶液GFP（図5B）を発現するために5.4から5.6、最も効率的に改変された細胞。したがって、低pHへの曝露は、試験の残りの選択のストレス処理のように焦点を合わせました。

[00182]次いで、細胞を決定した発現したOct4を変更されたストレスを維持するための最適な培養条件を。ES確立培地、3I：を含む、いくつかの前述の培地、⁹及びACTH ¹⁰、ES培養条件、ES-LIF ¹¹、胚

12 13 

神経幹細胞培養条件、B27-LIF、及びEpiSCsの培養条件は、検討しました。細胞を各培地に播種し、そしてGFP発現コロニーは（図5C）を計数しました。メディアB27-LIFは球状コロニーをGFP発現を生成する際に最も効果的であると思われました。したがって、B27-LIF培地を処理した細胞の培養に利用されました。

[00183]ストレス処理したCD45陽性細胞は、B27-LIF培地で培養し、全くGFPを発現するコロニーが未処理の対照（図1 A）で観察されなかったが、5日以内に、球状のコロニーをGFP発現が観察されました。球状​​のコロニーは、最初の7日間で直径約70μιηに成長し、球状のコロニーは、その培養条件でさらに7日間維持することができました。コロニーの構成はむしろ球よりも、植物学に見られるカルスと形状が類似登場する、ややバロックました。ストレス処理により生成された細胞コロニーは、したがって動物のカルス（AC）としました。培養細胞を解離させ、集団分析は、次いで、FACSを用いて行きました。分析は、特定の重要な刺激の適用は、以前にCD45陽性細胞集団（図1B）内に存在しなかった今動物カルス細胞（ACCS）と呼ばれるストレス改変細胞の生成をもたらしたことを明らかにしました。結果ストレス処理としてCD45陽性細胞の表現型の変化は、単一細胞レベルで観察されました。CD45陽性細胞は、GFPを発現しなかったが、ACCSは、CD45の発現が減少に関連したGFPを発現した（データは示さず）。単一細胞の検査は、処理された細胞の細胞サイズは、未処理細胞よりも小さく現れたことを明らかにしました。したがって、ACCS集団のセルサイズは、FACSによって分析しました。ACCSのセルサイズは、細胞の80％が直径（図1C）に8未満μιηあると、非常に小さかったです。

[00184]は1日目に1日目、3日目と7日目に分析したストレス処理したCD45陽性細胞CD45の減少とOct4の発現を、関連付けられた時系列の表現型の変化を調べるために、細胞のほとんどはまだなく、Oct4の、CD45を発現しました。3日目に、マーカー発現は、CD45陰性細胞またはCD45ネガティブ/ Oct4positive（dim）は、細胞を明らかに移行しました。7日目に、CD45の発現は消失し、Oct4の発現細胞（図ID）を観察しました。特に、培養の最初の7日間に、PI陽性細胞（死細胞）の数が徐々に増加した（データは示していない）、ストレス処理及び培養条件は、徐々に細胞の特徴を変更し、正常に改変された細胞のために選択されていることを示唆しています、のOct4を表明しています。

ACCSの[00185]キャラクタリゼーション。外部刺激への暴露の結果としての体細胞の再プログラミングを確認するために、ACCSの初期胚発生のマーカー遺伝子の発現を調べました。初期胚発生の陽性対照として、ES細胞は、以下の実験に使用しました。7日目での免疫蛍光染色は、球状コロニーはACCS、均一に発現し、多能性細胞マーカー、E-カドヘリン抗原、のNanog、SSEA-1、PCAM-1、およびAPを含むことを示した、と陽性であった：マーカー発現とDNAメチル化は、以下のように特徴付けられましたOct4-GFPため（データは示さず）。遺伝子発現解析は、そのACCSおよびES細胞ではなく、主要なCD45陽性細胞を示したのOct4、Nanogの、Sox2の、Ecatl、Esgl、Daxl、FGF5、Klf4のとRexl遺伝子（図2 A）の同等のレベルを表明しました。ACCSにおけるES特定の遺伝子の遺伝子発現は、7日目（図2A）でピークに達しました。亜硫酸水素塩配列決定はACCSでのOct4およびNanog遺伝子のプロモーターのメチル化状態を決定するために行きました。ACCSは、ES細胞（図2B）に見られるものと同様、これらの領域の広範な脱メチル化を示したネイティブリンパ球培養リンパ球対照試料は、両方のプロモーターで広範囲のメチル化を示しました。したがって、哺乳動物の体細胞が外部応力によって再プログラムされたことが実証されています。

[00186]はOct4の遺伝子発現は、GOFマウスでも野生型マウスにおいてのみならず、成熟細胞のストレス処理に起因することを確認するために、CD45陽性リンパ球は、ICRマウスから調達脾臓から回収しました。次いで、リンパ球をFACSを使用して、7日目までストレス処理にさらし、時系列分析しました。SSEA-1

SSEA-1 / E-カドヘリンの発現は、非ストレス処置対照群（図6A）において観察されなかったポジティブ/ E-カドヘリン陽性細胞集団は、ストレス処理群で見られました。これらの二重陽性細胞は、RT-PCR（図6B）により確認したOct4遺伝子発現を示しました。これらの結果は、ストレス処理の結果として、ACCS、発現細胞のOct4陽性および多能性マーカーは、かかわらず、マウス株のCD45陽性細胞から生成されたことを実証しました。

[00187]これらの結果は、成熟した完全に分化した成体の体細胞がストレス処理の結果として、「幹細胞性」に戻ったことを示唆しています。 

【00188】このACCSの幹細胞性を評価するために、彼らの自己複製能と分化能を調べました。彼らの自己再生能力を研究するためにクローン由来の集団を生成するための努力で、以前に成熟したCD45陽性リンパ球由来ACCSのコロニーは、単一の細胞に分離し、ウェル当たり1細胞で、96ウェルプレートに播種しました。十日、めっき後、球状コロニーを96ウェルの4で見られました。ACCSの分割時間は十分によくから変化しました。いくつかは12-16hに分割し、他のものは30-34hに分割します。ACCSは観察されたOct4の継続した発現と、少なくとも5回継代しました。したがって、ACCSは、自己再生のための潜在的な、インビトロで3つのすべての胚葉の細胞に分化する能力を実証しました。

[00189]は、成熟したGOFリンパ球由来ACSが再び単一の細胞に分離された、GFPを発現し、分化培地で培養した細胞の集団のみを含むように並べ替え。メッキ後の14-21日目に、細胞は外胚葉マーカー、βΙΙΙチューブリンおよびGFAP、中胚葉マーカー、平滑筋アクチン、および内胚葉マーカー、α-フェトプロテインおよびサイトケラチン7（データは示していない）を表明しました。したがって、ACCSは、in vitroでの三胚葉の細胞の代表に分化しました。

様々な成人組織から調達し、成熟した体細胞の[00190]ストレス変更。

ACCSは、成熟したリンパ球でなく、体細胞の他の種類だけでなく生成することができるかどうかを調べるために、脳、皮膚、筋肉、脂肪、骨髄、肺および肝臓のOct4-GFP（GOF）マウスから採取しました。細胞は、組織サンプルから単離された単一細胞に解離し、異なる物理的、または化学的なストレス条件で処理しました。細胞を変化させるプロセスの効率は、細胞の供給源と、細胞を曝露したために、ストレス条件（S）（図7A）の両方の関数として異なりました。あるOct4を発現するように成熟した細胞を変化させる応力の能力は、細胞の誘導に応じて異なるが、応力は、3つすべての胚葉（図7A）に由来する成熟した細胞ではある程度のOct4を発現するように細胞を改変することができました。任意の成熟組織由来のACCコロニーが多能性マーカーを発現し、Eカドヘリン、Nanogの、PCAM-1及びAP（データは示していない）、およびES特異的マーカー遺伝子（図7B）。重要な物理的・化学的ストレスは胚葉の組織のソースと派生のにもかかわらず、幹細胞の状態に戻すには、成熟した体細胞を変化させました。

[00191] ACCS発生の初期段階における細胞修正。これらの結果は、強力な物理的および化学的刺激が体細胞の再プログラミングをもたらすことを示しています。ストレス処理したリンパ球を5日以内にACを形成することが観察されました。これは、分子事象の急激な変化がストレス曝露の結果として発生したと仮定されました。研究は、したがって、刺激への曝露後の最初の7日間だったリプログラミングの初期段階に焦点を当てていました。

ACCSは著しいストレス曝露後に生存しているので、[00192]は、通常、細胞の損傷を修復するためにオン生存メカニズムがACCS生成中に誘導されたことが推測されました。まず、ストレスに対する細胞応答に関与する候補遺伝子の数の発現とDNA修復^14を比較した中で、ネイティブCD45陽性細胞とストレス処理したCD45陽性細胞における1日目、3日目と7日目の細胞応答遺伝子の発現がすでにありました1日目に観察され、これらの遺伝子は、ACCの生成細胞および他の細胞の混合物（図8）を分析したときに7日間にアップレギュレートされました。細胞応答遺伝子のアップレギュレーションは、ACCS発生と相関していたので、3日目及び7日目にACCSを選別し、そして遺伝子発現を分析しました。HiOaを除いて、すべての候補遺伝子は、ACCSの生成（図3A）の間に様々な程度にアップレギュレートされました。四熱ショック遺伝子とつのDNA修復遺伝子がACCS生成中にアップレギュレートすることが見出されました。また、アップレギュレート遺伝子の7は、細胞のレドックス状態の調節に直接関与することが知られています。これらの結果は、自己修復や自己防衛効力はACCSの生成中に誘導されたことを示唆しました。

ACCSは、細胞の酸化還元関連遺伝子のアップレギュレーションを示したので[00193]、ACCSのミトコンドリア機能は、次を検討しました。ミトコンドリアは、真核細胞内の酸素を使用して、酸化還元反応を介して、ATPの大部分の産生を担う細胞小器官です。ACC球状コロニーのGFP発現は徐々にコロニーが通過せずに培養した7日後、周辺に位置する細胞から減少しました。10日目に含まACCSは、中央細胞および非GFP分化末梢細胞（データは示さず）を発現するGFPを含有していました。ミトコンドリアの形態、ミトコンドリア特異的色素のMitoTrackerレッドで染色することによってACCSおよび分化した細胞において評価しました。ACCミトコンドリアは、分化した細胞は、細胞質内に繊維状およびワイドに広がっていた多くのミトコンドリアを含有した点状や球状に見える核周囲クラスターとして観察されました。ACCSのATP産生は、天然のCD45陽性細胞（図3B）よりも少なかったです。また、ACCSの反応性酸素種（ROS）の生産は、天然のCD45陽性細胞（図3C）よりも少なかったです。最後に、ミトコンドリアDNA複製に関与する重要な要因を評価しました。ミトコンドリア転写因子A（TFAM）である、ミトコンドリア特異的DNAポリメラーゼγ（Polg）とその付属部（Polg2）。ACCSでTFAM、Polg、およびPolg2の遺伝子発現は、分化した細胞（図3D）のものよりも低かったです。

その結果、ACCSは、ミトコンドリアの小さな数を含有し、ACCS「ミトコンドリア活性は、分化した細胞よりも低かったです。これらの結果は、ACCSが重度のストレス応答の後に生き残るために分化した細胞とは異なる代謝系を獲得したことを意味しました。

[00194] ACCSの発達の可能性。最後に、ACCSは、植物カルス細胞と同様の発生能を有しているかどうかを評価しました。発生能のための最初のテストとして、ACCSを検討したimmunodeficienct（SCID）マウスの皮下に移植しました。6週間の移植後、ACCSは、3つ全ての胚葉を代表する組織を生成した（データは示さず）。

[00195] ACCSは、インビボおよびインビトロですべての3つの胚葉の細胞の代表に分化しました。したがって、ACCSのキメラ貢献効力を評価しました。キメラ生成研究で使用するためのACCSは、フロリダGFP（C57BL / 6GFPXDBA / 2または129 / SvGFPxC57BL / 6GFP）またはGOF由来CD45陽性細胞を用いて調製しました。遺伝子発現解析は、7日目に、ACCSは、多能性マーカー遺伝子の高いレベルを発現したことが明らかになったので、7日目ACCSは、キメラマウス生成研究のために使用しました。最初に、キメラを生成するための従来の方法を利用しました。ACSは、トリプシンで処理することにより、単一の細胞に分離しました。ACCSは、その後胚盤胞（図4A）に注入しました。このアプローチを使用して、解離ACCSのキメラの寄与は非常に低い（表1）でした。したがってACCSは、しばしば、細胞の損傷させる前にトリプシン処理なし^15を、胚盤胞に注入しました。ACSは、顕微鏡下でマイクロナイフを使用して小さなクラスターに切断しました。ACの小さなクラスターは、その後胚盤胞（図4A）に注入しました。このアプローチを用いて、ACCSのキメラの寄与は劇的に（データは示さず）増加しました。ACCSで生成されたキメラマウスは、健康な育った（データは示していない）と生殖細胞系伝達が観察されています。各組織のキメラの寄与率は、FACSによって分析しました。結果は、ACCSは、すべての組織（図4B）に貢献したリンパ球に由来していることを示しました。

[00196]上で示したように、ACCSは、すべての3つの胚葉（図7A-7B）に由来する種々の細胞から生成することができます。様々な組織に由来するACCSが異なる分化傾向を持っていたかどうかを調べるために、ACCSはF1GFPマウス由来の様々な組織から生成された、およびICRの胚盤胞に注入します。次に、FACSを用いて、生成されたキメラマウスにおける各組織の寄与率を分析しました。これは、任意の組織に由来するACCSは、キメラマウス生成（図9）に寄与することが見出されました。加えて、皮膚、脳、筋肉、脂肪、肝臓および肺への寄与率は、種々の組織由来のACCSを使用して生成されたキメラマウスにおいて分析しました。任意の組織に由来するACCSは、すべての3つの胚葉の組織の代表を生成するために貢献し、そして何の分化傾向は（図9）は観察されませんでした。

[00197]、4Nのホスト胚盤胞での多能性細胞の注射することを含む、得られた胚を注入されたドナー細胞からのみ派生しているので、発生能のための最も厳格なテストを表す四倍体補完によるマウスの作製¹⁶ ACCSがDBAxB6GFP由来のリンパ球から生成されましたF1マウスまたは129 / SvGFPxB6GFP FL。ACCSが4N胚盤胞への注入後（中期）後期gastration「すべてACCの胚」の生成をもたらした（データは示さず）。遺伝子型決定分析は、「すべてのACC胚は「ACCSを生成するために利用された株の特定の遺伝子を有していたことを実証しました。したがって、ACCSはちょうど植物カルス細胞などのクローン体を生成する可能性を有していました。

[00198]考察 

【00199】哺乳動物の体細胞は、植物に非常に類似した方法で、重要な外部刺激への曝露の結果として動物のカルス（AC）形成のための能力を示します。これらのカルス（動物カルス細胞、ACCS）に含まれる細胞は、キメラマウスを作製するために、完全にACCSから生成された細胞のみからなる新しい胚を生成する能力を持っています。本明細書に記載の結果は、哺乳動物の体細胞が外部刺激により三胚葉のいずれかに分化する能力を回復することを示しています。これは、体細胞は、以前に考えられていたよりも大きな可塑性を持っていることを意味します。また、本研究では、遺伝子誘導または外来タンパク質を導入せずに体細胞の再プログラミングの可能性を実証し、成体幹細胞の潜在的に新たな洞察を提供しています。幹細胞生物学の解明における重要なマイルストーンを表します。

[00200]材料と方法 

【00201】組織採取および細胞培養。成熟したリンパ球の単離のために、GOFマウスまたはICRマウス由来脾臓をハサミに刻まれたと牧草地のピペットを用いて機械的に解離しました。解離脾臓を細胞ストレーナー（BD Biosciences社、サンノゼ）を介して株でした。回収した細胞をDMEM培地に再懸濁した後、15分間1000gで遠心分離しlympholyteの​​同じ体積（CEDARLANE®、オンタリオ、カナダ）を添加しました。リンパ球層を取り出し、CD45抗体（ab25603、真横、ケンブリッジ、MA）を用いて達成されました。CD45陽性細胞をFACSアリア（BD Biosciences社）によって分類しました。次に、CD45陽性細胞は、ストレス処理（15分間pH5.5の溶液）で処理し、1000U LIF（Sigma）及び10ng / mLのFGF 2（Sigma）を補充したB27培地にプレーティングしました。

[00202]外部刺激への曝露 - ストレス処理。細胞を成熟するために機械的ストレス、牧草地のピペットを与えるためには、加熱した後、直径で約50ミクロンのルーメンを作成するために延伸し、その後壊れました。成熟した体細胞は、その後、20分間、これらのピペットを介して粉砕し、7日間培養しました。細胞を成熟する低酸素刺激を提供するために、細胞を3週間、5％酸素培養器で培養しました。栄養刺激下で3週間の基本培地中で細胞を培養することにより、細胞を成熟するために提供されました。生理的ストレスへの成熟細胞を露出させるために、それらは、低pH（pH5.5の）溶液で処理し、7日間培養しました。また、細胞は、より深刻な被害を与えました。成熟した細胞膜の細孔を作成するために、細胞を、SLO（ストレプトリシンO）で処理しました。

[00203] SLO処理した細胞は、7日間、50分間、37℃での10μg/ mLのSLOを含むHBSS中でインキュベートし、SLOを含まない培地で培養しました。アンダー栄養ストレスに暴露された細胞を、2〜3週間の基礎培地で培養しました。「ATP」ストレスに暴露された細胞は、7日間の培養培地中で培養し、次いで15分間、37℃で2.4 mMのATPを含有するHBSS中でインキュベートしました。「CA」ストレスに暴露された細胞を、2mMのCaCl含む培養培地中で培養し、_2を 2週間。

[00204]バイサルファイトシーケンス。GOFマウスから調達した細胞のために単一の細胞に解離させました。GFP陽性細胞はFACSアリアにより使用して収集します。ゲノムDNAは、ACCSから抽出し、検討しました。DNAの重亜硫酸塩処理は、製造業者の説明書に従ってCpGenome DNA修飾キット（ケミコン、テメキュラ、CA、http://www.chemicon.com）を用いて行きました。得られた修飾されたDNAは、2つの順方向（F）プライマーおよび一つの後方（R）プライマーを使用して、ネストされたポリメラーゼ連鎖反応PCRによって増幅した：のOct4（FL、GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT（SEQ ID NO：1、F2、

ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA（SEQ ID NO：2）。 

R、CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC（SEQ ID NO：3））。およびNanog（FL、

GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT（SEQ ID NO：4）。F2、

AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT（SEQ ID NO：5）。R、

CCCACACTCATATCAATATAATAAC（配列番号：6））。PCRは、タカラ例のTaqホットスタートのバージョン（RR030A）を用いて行きました。DNA配列決定は、GRAS（ゲノム資源解析ユニット）の支援を受けてM 13プライマーを用いて行きました。

[00205]免疫組織化学。培養した細胞を4％parafolmaldehydeで固定し、1％BSA溶液（ライフテクノロジー、東京、日本）を用いて、0.1％トリトンX-100 / PBSブロッキング前で透過処理しました。二次抗体は、抗マウスヤギれたかのAlexa-488または-594（Invitrogen社）に結合され-rabbit。細胞核はDAPI（Sigma）で可視化しました。スライドをSlowFadeゴールド退色防止試薬（Invitrogen）を用いてマウントしました。

[00206]蛍光活性化細胞選別およびフローサイトメトリー。細胞は、標準的なプロトコルに従って調製し、FACSの前に氷上で、0.1％BS A / PBSに懸濁しました。PI（BD Biosciences）を死細胞を除外するために使用しました。細胞は、BD FACSARIA SORPにソートされ、BD FACSDivaソフトウェアのBD LSRII（BD Biosciences）で分析しました。

[00207] RNA調製およびRT-PCR分析。RNAをRNeasyを用いて単離しました

マイクロキット（QIAGEN）。逆転写はSupeSACript IIIファーストストランド合成キット（Invitrogen社）を用いて行きました。SYBRグリーンIミックス（Roche Diagnostics社）を増幅のために使用し、そしてサンプルを、ライトサイクラー-II機器（Roche Diagnostics社製）で行いました。

[00208]動物研究。腫瘍原性研究のために100mlのPBSに懸濁した細胞は、年齢をマッチさせた免疫不全SCIDマウスの側腹部に皮下注射しました。マウスを屠殺し、6週間後に剖検しました。

[00209] A TPとROSアッセイ。細胞間のATPレベルは、ATPによって測定しました。

生物発光アッセイキットHS II（Roche）を供給業者のプロトコルに従って。発光強度はGelomax 96マイクロプレートルミノメーター（Promega社、マディソン、WI）を​​用いて測定し、発光の読み取り値は、細胞数で標準化しました。ROSレベルの測定のために、細胞を培地中でインキュベートし、15分間、暗所で37℃で2μΜのジヒドロエチジウム（Molecular Probes）を含みます。次いで、細胞をPBSで洗浄し、0.5％BSAを含むPBS中に懸濁しました。30000細胞の蛍光強度は、BD Biosciences社LSR II（BD Bioscience社、スパーク、MD）を利用して記録しました。

[00210]キメラマウスの生成と分析。二倍体と四倍体の作製

キメラ。二倍体胚をBDF1雄と交配BDF1株雌から得たICRのオスと四倍体胚と交配ICR系統の雌から得ました。

17 

四倍体胚は2細胞胚の電気融合により作製しました。トリプシン処理は、低キメラが発生したため、本研究では、ACCS球状コロニーを顕微鏡下でマイクロナイフを使用して小片に切断し、ACCSの後、小さなクラスターは、大きなピペットで一日4.5胚盤胞に注入しました。次の日は、キメラ胚盤胞は一日2.5偽妊娠雌に移しました。

[00211]参照 

1. Brockes、JP＆クマー、A.可塑性および両生類の再生における分化細胞の再プログラミング。自然のレビュー。分子細胞生物学3、566から574、DOI：10.1038 / nrm881（2002）。

2. Sinnott、JJ＆Burklund、CW頸動脈不全の治療。ネブラスカ州の状態医学雑誌45、357から359（1960）。

3.ハンナ、J.ら。最終分化した成熟Bの直接再プログラミング

多能性にリンパ球。電池133、250から264、DOI：10.1016 / j.cell.2008.03.028

(2008) . 

4. Hockemeyer、D.ら。多能性のヒト体細胞の直接再プログラミングのための薬剤誘導系。細胞幹細胞3、346から353まで、

DOI：10.1016 / j.stem.2008.08.014（2008）。 

5.キム、D.ら。タンパク質の再プログラミングの直接送達によって、ヒト人工多能性幹細胞の生成。細胞幹細胞4、472-476、DOI：10.1016 / j.stem.2009.05.005

(2009) . 

6.キム、JBら。OCT4によるヒト神経幹細胞の直接再プログラミング。自然461、649から643、DOI：10.1038 / nature08436（2009）。

7.岡部、M.ら。多能性への造血細胞の直接再プログラミングのための決定的な証拠。血液114、1764から1767、DOI：10.1182 /血液2009-02-203695（2009）。

8. Ohbo、K.ら。思春期前における幹細胞の同定および特徴付け

マウスの小さな星での精子形成、充填されました。発生生物学258、209から225（2003）。

9.英、QLら。胚性幹細胞の自己再生の基底状態。自然453、519から523、DOI：10.1038 / nature06968（2008）。

10.小川、K.、松井、H.、大塚、S＆丹羽、マウスES細胞のクローン増殖を調節するためのH. A新たなメカニズム。細胞への遺伝子：分子＆細胞メカニズムに専念9、471から477、DOI：10.111リットル/ j.l356-9597.2004.00736.x（2004）。

11.ゴフ、NMら。LIF：骨髄性白血病細胞や胚性幹細胞に発散作用を有する分子。繁殖、生殖能力、および開発1、281-288（1989）。

12.仁、S。ら。哺乳動物の胚盤葉上層から原始神経幹細胞は、Notchシグナル伝達の制御下に決定的な神経幹細胞に分化します。ジーンズ・アンド・ディベロップメント18、1806から1811、DOI：10.1101 / gad.1208404（2004）。

13. Tesar、PJら。ヒト胚性幹細胞と機能を定義し、マウスの胚盤葉上層の共有から新規の細胞株。自然448、196から199、DOI：10.1038 / nature05972（2007）。

14. Saretzki、G.、アームストロング、L.、リーク、A.、Lako、M.＆フォンZglinicki、マウス胚性幹細胞におけるT.ストレス防御は、様々な分化したマウス細胞のそれよりも優れています。幹細胞22、962から971、DOI：10.1634 / stemcells.22-6-962（2004）。

Mitalipova、MMら。ヒト胚性幹細胞の遺伝的完全性を維持します。ネイチャーバイオテクノロジー23、19-20、DOI：10.1038 / nbt0105-19（2005）。

ナジ、A.、Rossant、J.、ナジ、R.、Abramow-Newerly、W.＆Roderの、早期継代胚性幹細胞から完全に細胞培養由来のマウスのJCの導出。 

アメリカ90、8424から8428の米国（1993）の国立科学アカ​​デミー紀要。 

ナジ、A.ら。胚性幹細胞は、単独でマウスに胎児の発育をサポートすることができます。現像110、815から821（1990）。 

表1：ACCSからキメラマウスの作製 

キメラマウスの号

の細胞号 

得られた製剤文化受精 

総高歪注入嚢号子孫の寄与を注入した胚の期間、マウス**

BDF1シングル7日40 32 1 0

BDF1クラスタ7日58 48 * 16 4

129B6F1クラスタ7日98 64 20 6

GOFクラスタ7日73 35 24 2

GOFクラスタ35 20 4 0 10日

*すべての胎児は15.5 DPCに13.5 DPCで収集し、各器官へのACCSの寄与率は、FACSで調べました 

**各キメラへのSACの寄与が高い（GFP発現の毛色の> 50％）として採点しました 

表2：プライマー配列。7-39と上から下に含まれている右側の列、配列番号：40から72まで中央の列は、上から下、配列番号に、含まれています。

例2：多能性への体細胞の刺激・トリガ・フェイト変換 

本明細書中に記載[00212]は、核初期化の現象であり、「刺激トリガー取得多能性」の強い外部からの刺激が十分に核移植を使用して、または転写因子を導入することなく、多能性細胞への哺乳動物の体細胞を再プログラム（STAP）、。LIFの存在下では、一過性の低pHのストレスは、CD45の脱分化引き起こし⁺などのOct3 / 4などの多能性細胞マーカーを発現し、三胚葉分化の能力を持つ細胞に造血細胞を。これらSTAP細胞では、ES細胞のような、実質的に脱メチル化は、OCT3 / 4およびNanogプロモーター領域に見られます。造血細胞由来のSTAP細胞がコミット体細胞は、系統変換によりSTAP細胞を生じさせることを示し、T細胞受容体における遺伝子再配列を運びます。胚盤胞の注入は、STAP細胞が効率的であっても四倍で、キメラに寄与することを示しています

相補性アッセイ、および生殖系列伝達を介して子孫へ。このように、運命の決意のエピジェネティックな状態が根本的に強い環境の合図により、コンテキストに依存した方法で初期化することができます。

細胞分化が下り坂に行くように[00213]ワディントンのエピジェネティックな風景の疎通のレビューでは、体細胞の運命を漸進的に決定されます。分化細胞状態の反転は、核移植としての核機能の、人工的な物理的または遺伝的、操作を必要と考えられ、一般的にされて¹と、複数の転写因子を導入。これは、体細胞は、これらの直接核操作することなく、単に外部トリガに応答して、それらの核プログラムの初期化を受けることができるかどうかを未解決のままです。このような状況は、植物で発生することが知られています。培養環境の急激な変化は、成熟した体細胞の運命を変えることができ、例えば、茎や根などの植物全体の構造は、オーキシンの存在下で発達するから未熟芽細胞、に、ニンジン細胞を解離しました。挑戦的な問題は、動物の体細胞は、少なくとも特別な条件の下で現れる同様のポテンシャルを有することができるかどうかです。過去10年間、成体組織における多能性細胞（または密接に関連する細胞型）の存在が結論は、様々なグループによって報告された競合しているために、論争の種となっています。しかし、それらのいずれも、そのような多能性細胞は、分化した体細胞から生じることができることを実証していません。

CD45（白血球共通抗原）に対してポジティブ[00214]造血細胞は、しばしば、このようなiPS細胞の誘導体としてリプログラミング研究のための細胞タイプを出発物質として使用されている典型的な系列拘束体細胞です。再プログラムしない限り、彼らはそのようなのOct3 / 4などの多能性関連マーカーを発現することはありません。特に、CD45の最も⁺脾臓組織からの細胞は、（成熟細胞または前駆細胞）非幹白血球集団であると考えられ、iPS細胞の変換T細胞レセプターβ鎖のゲノム再編成を運ぶリンパ球から（tcrfi）遺伝子とみなされコミットされた体細胞から再プログラミングのための善意の顕著な特徴。したがって、本発明者らは、脾臓のCD45かどうかの問題に興味をそそらなった⁺細胞は、このような単純な化学的摂動によって引き起こされるもののような外部環境の急激な変化により、多能性を獲得するために変換することができます。

[00215]結果 

コミットされた体細胞に運命の変換を誘発した[00216]低pH処理。CD45 ⁺ OCT3 / 4 :: GFP B6マウスから調達成人の脾臓から採取した細胞、^15は、懸濁液中で培養した後、物理的および化学的なものを含む、強力な過渡刺激、様々なタイプのにさらされ、OCT3 / 4プロモーターの活性化について調べました数日間、LIF含有B27培地を使用して。これらの様々な摂動の中でも、低pHの乱れに着目しました。以下に示すように、摂動のこのタイプは、OCT3 / 4誘導において最も有効であることが判明しました。

関係なく、ソートされた細胞の生存を許容したLIFを含む培地で培養期間のGFP：[00217]刺激に触れることなく、CD45で選別された細胞のいずれも、OCT3 / 4を発現しませんでした。これとは対照的に、脾臓のCD45の30分間の処理⁺低pHのメディア（pH4.5-6.0;図12A）を持つ細胞は、OCT3 / 4 :: GFFのかなりの数の出現に起因⁺ 7日目（D7）で細胞を文化（図12B;最も有効な範囲はpH5.4-5.8であった;図16B）。：追加の7日間、少なくとも継代することなく、GFP（14日合計）：これらの細胞は、OCT3 / 4を発現し続けました。この非接着培養のD7で、低pHに誘発さOCT3 / 4：GFP細胞は球状（またはわずかにバロック）に形成されたクラスタ（データは示されていない、数十セルに数からなる）もはやCD45（発現、図12C）。興味深いことに、低pH誘発のOCT3 / 4のセルサイズ：GFP ⁺細胞は無処理CD45のそれよりも実質的に小さいた⁺細胞（OCT3 / 4の免疫染色を参照してください：単一細胞におけるGFPおよびCD45;図12C ）; そのコントロールのCD45前者の細胞の80％が直径8未満μιηあった⁺細胞が10μιηに8の範囲であった（図12Dは、（左のピークはのOct3 / 4 :: GFP +細胞を示し、右のピークはCD45 +細胞）の順方向によって推定を示していますFACSでの散乱分析）。GFP：これらの観察は、OCT3 / 4との間に劇的な変化を示唆している⁺およびCD45 ⁺ 2のマーカーの発現の差を越えた集団を。

【0218】経時的解析（図12C）は、DL-D3の間の細胞集団の動的な変化を示しました。（生存細胞数が行う人口の-85％に相当する）DLに生存細胞のほとんどはまだCD45た⁺およびOCT3 / 4：GFP ^「 D2およびD3には、かなりの人口（それぞれ21％と34％、。 ）総生存細胞のは、OCT3 / 4になった：GFP ⁺およびCD45のための薄暗いあった（図12C、播種した細胞の-50-60％がそれまでに失われた）D7で、OCT3 / 4、かなりの数：。：GFP ⁺ / CD45 ^"細胞（総生存細胞の54％）は、OCT3 / 4から明確な集団を構成する：GFP7CD45 ^「 1（図12B、トップ; D7上の総細胞数はD3上のものに類似していた）のは明らかな世代。 OCT3 / 4 :: GFP ⁺ / CD45は^〜集団は、非処理CD45の文化の中で見られた⁺細胞（図12B、下）したがって、OCT3 / 4の数：。：GFP / CD45 ^〜低pHの人口-処置グループはかなり充実しておよびD7上の総生存細胞の約半分に相当するOCT3 / 4実際、中：。：GFPシグナルが最初D2に登場し、GFPの数⁺細胞が最初にメッキの-8％に相当CD45 ⁺。細胞はので、それは非常にマイナーな人口（例えば、夾雑CD45とは考えにくい登場^"：GFP：細胞）を迅速に、このような実質的なOCT3 / 4を形成するために成長しました⁺低pH処理後の最初の2日間以上の人口を。

[00219]生の画像解析（データは示していない）、低pH値で処理されたCD45に⁺細胞ではなく、未処理細胞、徐々に最初の数日にわたってGFP信号をオンに小さなクラスターを形成する傾向がありました。そして、これらの小さなOCT3 / 4：GFP ⁺クラスターはしばしば融合およびクラスタがマルチクローンであることを示し、D5により大きな球を形成しました。興味深いことに、これらのGFP ⁺クラスター（ただしGFP ^」細胞）は、非常に移動しており、多くの場合、突出細胞プロセスが（データは示さず）。

[00220]系列拘束脾臓CD45か否かを試験するために⁺細胞、特に、T細胞集団、OCT3 / 4に貢献しました：GFP ⁺細胞は、tcrfiのゲノム再編成は、単離され、OCT3 / 4で調べた：GFPは⁺ゲノムによって球PCRと、各球が（データは示していない）tcrfi遺伝子再編成を有する細胞を含有していることがわかりました。汚染に再配列を検出する可能性を排除するためにOCT3 / 4：GFP7CD45 ⁺細胞、OCT3 / 4：GFP / CD45は^〜細胞がD7にFACSでソートし、tcrfi遺伝子再構成アッセイに供しました。この場合も、tcrfi遺伝子再配列が明らかに（図12E）が観察されました。これらの知見は、脾臓細胞内のコミット体細胞集団（少なくとも、T細胞）は、OCT3 / 4に貢献したことを示している：：GFP ⁺細胞CD45から自分の運命を変換することにより⁺、OCT3 / 4に：GFP ⁺。

[00221]低pHに誘発されるのOct3 / 4 ⁺細胞が多能性を持っています。これは、次のOCT3 / 4かどうかを調べてみた：GFP ⁺刺激によって誘発される細胞における発現は、多能性を獲得することなく、これらの細胞の多能性状態または遺伝子発現パターン（この場合は、OCT3 / 4、CD45）で、単に特定の変化を表します。免疫染色は、そのD7のOCT3 / 4を示した：GFP ⁺球は、のOct3 / 4、SSEA-1、Nanogの、E-カドヘリン及びAP（データは示していない）のような多能性関連マーカーを発現しました。定量PCRによる遺伝子発現解析低pHに誘導したことをOCT3 / 4を示した：GFP ⁺ D7上の細胞は、CD45とは異なり⁺細胞、それらにOCT3 / 4、NANOG、SOX2、ecatl、esgl、daxlおよびKLF4遺伝子の同等のレベルで発現し、低pHがあることを示す; ES細胞（これらのマーカーは既にD3に陽性であった。図13 A（シリーズは左から右へ、OCT3 / 4、NANOG、SOX2、ecatl、esgl、daxlおよびKLF4式から、表す））で誘導性OCT3 / 4：GFP ⁺細胞はCD45で表現されることはありません多能性のbona-善意マーカー遺伝子セットの特性、表現⁺細胞を。

[00222]これは、次の遺伝子発現パターンにおけるこの劇的な変化は、多能性関連遺伝子のエピジェネティックな修飾の変化を伴っていたかどうかを試験しました。この目的のために、重亜硫酸塩シークエンシングは、OCT3 / 4およびNanogプロモーター領域のメチル化状態を調べるために行きました。CD45 ⁺細胞は、または追加の文化なしに、両プロモーターで頻繁にメチル化パターンを示しました。これとは対照的に、低pH誘発のOCT3 / 4：GFP ⁺細胞は、細胞がために、これらの重要な遺伝子にエピジェネティックな状態の実質的な再プログラミングを受けたことを実証し、ES細胞（図13B）のように、これらの地域で大規模な脱メチル化を示しました。

多能性。 

[00223]それは、次の低pHに誘発された細胞は、多能性のための共通の基準である3胚葉誘導体を生成する能力を持っているかどうかを調べました。両方のin vitro分化アッセイ（データは示していない）とteratoma-形成試験（データは示さず）、これらの細胞がecodermalを生じさせることができることを実証した（例えば、βチューブリンIII ⁺）、中胚葉（例えば、平滑筋アクチン⁺）及び内胚葉（例えば、アルファフェトプロテイン⁺）細胞。

[00224]は、集合的に、これらの知見は、コミットされた体細胞系譜の分化状態が外部から与えられた強い刺激によって多能性の細胞の状態に変換することができることを示しています。以下では、このような低pHのような強力な外部刺激による多能性細胞への体細胞から運命の変換は、「刺激トリガー取得多能性」（STAP）およびSTAP細胞として得られた細胞と呼ばれています。

他の組織源から[00225] STAP細胞。STAP細胞についてのもう一つの重要な問題は、低pH値でトリガ変換の現象はCD45に制限されているかどうかである⁺白血球。この問題に対処するために、同様の変換実験は、脳、皮膚、筋肉、脂肪、骨髄、肺およびOCT3 / 4 :: GFPマウスの肝臓組織から採取した体細胞を用いて行きました。

組織サンプルから[00226]細胞は、一過性の低pHの曝露に供し、LIFを含む培地で培養し、単一の細胞に解離させました。変換効率は、それらの起源の組織の間で変動するが、OCT3 / 4：GFP ⁺左から右に、細胞を再現性、一連の表現（D7培養物（図14Aで観察された、CD45 +細胞、骨髄、脳、肺、筋肉、脂肪、線維芽細胞、肝臓、および軟骨細胞）。なお、STAP細胞を効率的にCD45脂肪組織のmesechymal細胞（データは示していない）から誘導された⁺ことを示し、軟骨細胞の初代培養細胞から、細胞はまれであった、非CD45 ⁺細胞集団は、STAP細胞に上昇を与えることができ、これらのOCT3 / 4：。：GFP ^+の細胞クラスターはまた、多能性関連マーカー（図14B（シリーズは、左から右へ、表す、のOct3 / 4、Nanogの、Sox2の、O式を表現しますKLFとRexl）および図18（b）データは示さず）、およびES細胞特異的マーカー遺伝子（図14Bおよび図18B）。

多能性細胞としてSTAP細胞の[00227]特徴。したがって、STAP細胞はES細胞特異的遺伝子を発現し、OCT3 / 4およびNanog遺伝子における類似のメチル化パターンを示します。また、STAP細胞は、LIFを含む培地のようなマウスES細胞用培地で確立することができるではなく、マウスEpiSC培地（データは示さず）。

STAP細胞は、マウスES細胞に実質的な類似性を示したが、[00228]しかしながら、いくつかの別個の機能も見出されました。例えば、STAP細胞は限られた自己再生能力を示しました。STAP細胞球体は酵素的に、96ウェルプレートの各ウェルにクローン培養のために単一細胞に解離されたマウスES細胞（データは示していない）とは異なり、コロニー（AP ⁺またはOCT3 / 4：GFP ^+で）形成された追加後接着剤または非接着性のいずれかの条件下でLIFを含む培地（G-MEM-またはB27ベース）（データは示さず）で10日間培養。球状コロニー形成がまれに（96ウエルのうち2-4ウェル中で、典型的には）見られたのに対し、これらのコロニーは、すべてのAPた^」：GFPおよびOCT3 / 4 ^"。STAP細胞の球が部分的に解離し、高細胞密度の条件下で培養した場合であっても（データは示されていない;自己複製のための、おそらくもっと協力的）、細胞数は、2つの通路と後に減少し始め、OCT3 / 4：GFP ⁺細胞があることができませんでした5継代を超えて維持しました。成長および維持のためのこれらの特性は、STAP細胞がその機能マウスESとのiPS細胞から部分的に区別される多能性細胞集団を表すことを示唆しています。

[00229]マウスEpiSCs分化段階でわずかにより高度であると考えられている多能性幹細胞の別のカテゴリーです。STAP細胞は、いくつかの側面にEpiSC細胞から明確に動作するように思われました。以下のような接着培養では、マウスES細胞、OCT3 / 4：GFP ⁺マウスEpiSCsに見られる単層フラットコロニーとは異なり、積み上げによって半球状のコロニーを形成する細胞。STAP細胞は、それらがEpiSCsに異なることを示唆している、のいずれか、EpiSC培地で維持することができなかった（データは示さず）。また、EpiSC（参考文献;大串）の単一細胞継代を改善ROCK阻害剤を用いた治療は、解離STAP細胞からのコロニー形成を促進しなかった（データは示さず）。

[00230]免疫染色は、STAP細胞がEp​​iSCマーカーに関して陰性であったことを示しました

クローディン7、およびZO-1およびKLF2 / 4について陽性（データは示さず）。ES細胞、STAP細胞とEpiSCs間のグルーピングelf5式はSTAP細胞で特異的に低い間、ES細胞マーカーEsrrBの発現は、両方のSTAP細胞とEpiSCsに低かったので、そう単純ではないかもしれません（図15 A（シリーズ表します、左から右へ、ES、EpiSC、STAP、およびCD45））。ゲノム全体のトランスクリプトームのクラスタ分析では、STAP細胞はES細胞に最も近いであり、それらは親のCD45から最も離れている間、RNA発現の胚盤胞への実質的な類似性を持つ⁺細胞（データは示さず）。STAP細胞におけるX染色体不活性化の状況が興味深いでした。X染色体不活性化は残り（〜60％）（図15B）でキャンセルされた一方で女性STAP細胞（D7）の-40％は、不活性化された染色体を示しました。

[00231]これらの知見は、STAP細胞の分化状態が密接に関連するが、ES細胞のものとは異なる新たな準安定な多能性状態を表すことができるという可能性を提起しました。 

[00232]キメラ形成およびマウスにおける生殖系列伝達。最後に、

chimera- STAP細胞の形成能力は、胚盤胞注入アッセイによって評価しました。STAP細胞（B6-その背景）は、単一の細胞に分離し、ICR胚盤胞に注入したとき、ES細胞とは異なり、濃い毛色を運ぶ全くキメラマウス（表4）に生まれませんでした。単一STAP細胞はほとんどインビトロで維持することができないので、携帯解離が何とか自分の能力を変更したことが推測されました。したがって、STAP細胞クラスターを手動で顕微鏡下でマイクロナイフを用いて小片に切断し、胚盤胞に一括注入した（データは示さず）。この演習では、キメラマウスは、かなりの割合で生まれ、すべてが（データは示していない）、通常開発されました。次に、CD45から生成された注入されたSTAP細胞の組織への貢献だっ調べ⁺恒常的にGFPを発現するマウスの細胞（C57BL / 6GFPのFLがDBA / 2または129 / SVと交配）。GFP発現細胞の中程度の寄与に高いがSTAP細胞塊を注入し、キメラ胚で見られた（データは示さず）。

[00233]のGFPの寄与率^+の各組織における細胞をFACSによってこれらのキメラ胚で分析しました。CD45 ⁺細胞由来のSTAP細胞は、試験した全ての組織（データは示していない）に貢献しました。また、STAP細胞由来の子孫は、キメラマウス（表5）に生まれました。生殖系列伝達が厳しいとみなされるので、STAP細胞のこの電位は、重要であり、これらの多能性細胞の真の性質を示しています

22 

多能性だけでなく、遺伝的およびエピジェネティックな正規の基準。（4N）四倍体相補性アッセイは、次いで、得られた胚のみこれらのドナー細胞23（データは示していない）から導出されるので、注入された細胞の発達の効力のための最も厳しい試験であると考えられている4N胚盤胞への細胞を注射することによって行いました。4N胚盤胞に注入すると、CD45 ^+の細胞由来STAP細胞（DBAの*のB6GFPからか

129 / SV * B6GFP F1マウス）生成」全てのGFP ⁺ E10.5の胚'（データは示していない）は、単独でSTAP細胞全体胚構造を構築するのに十分であったことを実証します。

[00234]はまとめると、これらの知見は、明示的STAP細胞は、胚性環境のコンテキスト内のすべての体細胞および生殖細胞系統に分化する発生能を有することを示します。 

[00235]考察 

[00236]本明細書に記載されたデータは、体細胞が潜伏有することが驚くほど柔軟な可塑性を明らかにしました。彼らはない通常どおり生活環境で経験することを細胞が一過性の強い刺激にさらされている場合は、このダイナミックな可塑性は、あっても多能性細胞に変換する、出てきます。

[00237] CD45から変換⁺細胞をSTAPする細胞は、実質的にHDAC阻害剤（例えば、Tricostatin A）を用いた治療または5-アザ-シチジンによって少なくとも影響を受けませんでした。

【00238】なお、本明細書において実証される低pH値の処理は、実質的に培養中の細胞の数を減少させました。しかし、実際には、最初の24時間の間に生存細胞の減少は、この治療は、細胞の大部分に急性の致死効果を与える可能性は低いことが示唆された、限界でした。その代わりに、遅延セル損失が徐々にD2〜D5中に発生しました。これと一致して、データが多数の遺伝子は、ストレスに対する細胞応答に関与することを実証したと

21 ^「 I-

DNA修復が強く、低pHに経験豊富なOCT3 / 4で誘導した：同じ培地でd3の上ではなく、対照細胞におけるGFPの細胞を培養し、細胞が生命に脅威と、または亜致死、応力として刺激に応答したことを示唆しています。興味深いことに、それらの遺伝子の発現レベルはD7でも高くなります。したがって、おそらく、細胞の生存のためのストレス誘導遺伝子の役割だけでなく、再プログラミングプロセスにおける彼らの関与の可能性だけでなく、を調査するために、将来的に興味をそそられます。

[00239]別の未解決の問題は、携帯電話のリプログラミングは、低pH処理によって、あるいはまた、そのような物理的な損傷などの亜致死ストレスのいくつかの他の種類によって特異的に形質膜の穿孔、浸透圧ショック、成長因子を開始することができるかどうかであります 

2__|_ 

剥奪、低酸素症および高カルシウムメディア露出。特に、少なくともそれらの一部、Oをストレプトリシンにより厳格な摩砕し、膜の穿孔による特定、物理的損傷で、OCT3 / 4の生成を誘導した：GFP ⁺ CD45からの細胞⁺細胞（図18A）。これらの知見は、特定の共通の調節モジュールは、エピジェネティック制御における地球変動につながる、分化のしっかりとロックされたエピジェネティックな状態から体細胞を解除するためのキーとして機能し、これらの遠縁亜致死ストレスの下流に横たわっているという可能性を高めます。与えられたいくつかのOCT3 / 4：GFP ⁺ d2だけ登場した細胞は、このようなリプログラミング機構は最初の2日以内に関数に起動することがあります。

[00240]参照 

1和歌山、T.、ペリー、A. C、Zuccotti、M.、ジョンソン、KR＆柳町、卵丘細胞核を注入し除核卵母細胞からマウスのR.フル長期的な開発。自然394、369-374、DOI：10.1038 / 28615（1998年）。

2高橋、K.＆山中、定義された要因によるマウス胚および成体の線維芽細胞培養物からの多能性幹細胞のS.誘導。電池126、663から676まで、

DOI：10.1016 / j.cell.2006.07.024（2006）。 

3江、Y.ら。成人の骨髄由来の間葉系幹細胞の多能性。自然418、41-49、DOI：10.1038 / nature00870（2002）。

4 D'Ippolito、G.ら。骨髄単離された大人の多誘導性（MIA​​MI）細胞、大規模な拡張と分化能と出生後の老いも若きも、ヒト細胞のユニークな集団。細胞科学誌1 11、2971から2981、DOI：10.1242 / jcs.01103

(2004) . 

5ジョンソン、J.ら。骨髄および末梢血中の推定生殖細胞による哺乳類成体卵巣で卵母細胞の生成。電池122、303から315、DOI：10.1016 / j.cell.2005.06.031

(2005) . 

6 Kucia、M.ら。非常に小さな胚様（VSEL）の人口

CXCR4（+）SSEA-L（+）のOct-4 +成人骨髄において同定幹細胞。白血病：公式のアメリカの白血病学会誌、白血病研究基金、英国20、857から869、DOI：10.1038 / sj.leu.2404171（2006）。

7黒田、Y.ら。成人のヒト間葉系細胞集団におけるユニークな多能性細胞。アメリカ107、8639から8643、DOIの米国の全米科学アカデミー紀要：10.1073 / pnas.091​​1647107（2010）。

8小保方、H.ら。成人幹細胞の電位は、三胚葉を代表する組織します。組織工学。パート17、607から615、DOI：10.1089 / ten.TEA.2010.0385（2011）。

9 Rahnemai-アザー、A.ら。ヒト骨髄単離された大人の多誘導性（MIA​​MI）細胞は、マウスモデルにおける末梢血管の虚血から保護します。Cytotherapy 13、179-192、DOI：10.3109 / 14653249.2010.515579（2011）。

10黄、Y.ら。骨髄移植は、一時的にストレプトゾトシン誘発糖尿病において膵臓機能を改善：非常に小さいの潜在的な関与を

胚様細胞。移植89、677から685、DOI：10.1097 / TP.0b013e3181c9dc7d（2010）。

11 Zuba-スルマ川、EKら。拡張した骨髄由来の非常に小さな胚様幹細胞（VSEL-SCS）の移植は、心筋梗塞後の左室機能およびリモデリングを改善します。細胞および分子医学15のジャーナル、1319年から1328年、DOI：10.1111 / j.1582-4934.2010.01126.x（2011）。

12 Paczkowska、E.ら。アルデヒド脱水素酵素（ALDH） - 高の長期再増殖造血ポテンシャルの多能性の前臨床および臨床の選択で使用するための有望な新しい候補非常に小さな胚様幹細胞（VSELのSC）。実録

移植：ポーランド移植学会16、59-71（2011）の四半期ごと。 

13 Lengner、CJ、Welstead、GG＆イェーニッシュ、R.多能性レギュレータのOct4：体性幹細胞における役割？細胞周期7、725から728（2008）。

14ベルク、JS＆グッデル、体性幹細胞であるOct4の役割に対するMAアン引数。細胞幹細胞1、359から360、DOI：10.1016 / j.stem.2007.09.007（2007）。

15 Ohbo、K.ら。マウスの小さな星で思春期前の精子形成における幹細胞の同定および特徴、満たされました。発生生物学258、209から225（2003）。

16英、QLら。胚性幹細胞の自己再生の基底状態。自然453、519から523、DOI：10.1038 / nature06968（2008）。

17小川、K.、松井、H.、大塚、S＆丹羽、マウスES細胞のクローン増殖を調節するためのH. A新たなメカニズム。細胞への遺伝子：分子＆細胞メカニズムに専念9、471から477、DOI：10.111リットル/ j.l356-9597.2004.00736.x（2004）。

18ゴフ、NMら。LIF：骨髄性白血病細胞や胚性幹細胞に発散作用を有する分子。繁殖、生殖能力、および開発1、281-288（1989）。

19仁、S.ら。哺乳動物の胚盤葉上層から原始神経幹細胞は、Notchシグナル伝達の制御下に決定的な神経幹細胞に分化します。ジーンズ・アンド・ディベロップメント18、1806から1811、DOI：10.1101 / GAD。l208404（2004）。

20 Tesar、PJら。ヒト胚性幹細胞と機能を定義し、マウスの胚盤葉上層の共有から新規の細胞株。自然448、196から199、DOI：10.1038 / nature05972（2007）。

21 Saretzki、G.、アームストロング、L.、リーク、A.、Lako、M.＆フォンZglinicki、マウス胚性幹細胞におけるT.ストレス防御は、様々な分化したマウスの細胞のものよりも優れています。幹細胞22、962から971、DOI：10.1634 / stemcells.22-6-962（2004）。

22 Surani、MA＆バートン、マウスにおける雌性発生卵のSC開発： 

単為生殖胚のための含意。科学222、1034から1036まで（1983）。

23ナジ、A.、Rossant、J.、ナジ、R.、Abramow-Newerly、W.＆Roderの、早期継代胚性幹細胞から完全に細胞培養由来のマウスのJC導出。アメリカ90、8424から8428の米国（1993）の国立科学アカ​​デミー紀要。

24 AP Dyban、哺乳類の胚発生のVSB細胞遺伝学。オックスフォード大学。プレス、ニューヨーク（1987）。

25 Gropp、A.、ウインク、H.、Herbst氏、EW＆クラウセン、CPマウストリソミー： 

発達胚のプロファイル、およびトリソミーセルラーシステムの分離。実験動物学228、253から269のジャーナル、DOI：10.1002 /ジェズ。l402280210（1983）。

[00241]材料と方法 

【00242】組織採取および細胞培養。成熟したリンパ球を単離するために、1週齢のGOFマウスまたはICRマウス由来脾臓を、ハサミに刻まれ、

牧草ピペットで機械的に解離しました。解離脾臓を細胞ストレーナー（BD Biosciences社、サンノゼ）を介して株でした。回収した細胞をDMEM培地に再懸濁した後、15分間1000gで遠心分離しlympholyteの​​同じ体積（CEDARLANE®、オンタリオ、カナダ）を添加しました。リンパ球層を取り出し、CD45抗体（ab25603、真横、ケンブリッジ、MA）を用いて達成されました。CD45陽性細胞をFACSアリア（BD Biosciences社）によって分類しました。次に、CD45陽性細胞は、ストレス処理（15分間pH5.5の溶液）で処理し、1000U LIF（Sigma）を補充したB27培地にプレーティングしました。

[00243]外部刺激への曝露 - ストレス処理。細胞を成熟するために機械的ストレス、牧草地のピペットを与えるためには、加熱した後、直径で約50ミクロンのルーメンを作成するために延伸し、その後壊れました。成熟した体細胞は、その後、20分間、これらのピペットを介して粉砕し、7日間培養しました。細胞を成熟する低酸素刺激を提供するために、細胞を3週間、5％酸素培養器で培養しました。栄養刺激下で3週間基礎培地中で細胞を培養することにより、細胞を成熟するために提供されました。高カルシウム培養濃度は7日間の2mMのCaCl 2を含有する培地中で細胞を培養することにより、細胞を成熟するために提供されました。生理的ストレスへの成熟細胞を露出させるために、それらは、低pH（pH5.5の）溶液で処理し、7日間培養しました。また、細胞は、より深刻な被害を与えました。成熟した細胞膜の細孔を作成するために、細胞を7日間培養し、その後、2時間230 ngの/ mlのSLO（ストレプトリシンO）（S5265、Sigma）で処理しました。

[00244]バイサルファイトシーケンス。GOFマウスから調達した細胞のために単一の細胞に解離させました。GFP陽性細胞はFACSアリア™により使用して収集します。ゲノムDNAは、のSACから抽出し、検討しました。DNAの重亜硫酸塩処理は、製造業者の説明書に従ってCpGenome™DNA修飾キット（ケミコン、テメキュラ、CA、http://www.chemicon.com）を用いて行きました。

[00245]得られた修飾されたDNAは、ネストされたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅しました。 

2つの順方向（F）プライマーおよび1リバース（R）プライマーを用いてPCR：Oct4の（FL、 

GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT; F2、ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA; R、C CACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC）。およびNanog

（F1、GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT; F2、AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT; R、C CCACACTCATATCAATATAATAAC）。PCRは、タカラ例のTaqホットスタートのバージョン（RR030A）を用いて行きました。DNA配列決定は、GRAS（ゲノム資源解析ユニット）の助けを借りて3mlのプライマーを用いて行きました。

[00246]免疫組織化学。培養した細胞を4％parafolmaldehydeで固定し、1％BSA溶液（ライフテクノロジー、東京、日本）を用いて、0.1％トリトンX-100 / PBSブロッキング前で透過処理しました。二次抗体は、抗マウスヤギれたかのAlexa-488または-594（Invitrogen社）に結合され-rabbit。細胞核はDAPI（Sigma）で可視化しました。スライドをSlowFadeゴールド退色防止試薬（Invitrogen）を用いてマウントしました。

[00247]蛍光活性化細胞選別およびフローサイトメトリー。細胞は、標準的なプロトコルに従って調製し、FACSの前に氷上で、0.1％BSA / PBSに懸濁しました。PI™（BD Biosciences社）は、死細胞を排除するために使用されました。陰性対照は、一次抗体は、特異性を保証するために、同一のアイソタイプのIgGを陰性対照と交換しました。細胞は、BD FACSARIA SORP™でソートし、BD FACSDiva™ソフトウェアを使用したBD LSRII™（BD Biosciences）で分析しました。

[00248] RNA調製andRT-PCR分析。RNAをRNeasy™を用いて単離しました

マイクロキット（QIAGEN）。逆転写はSupeSACript IIIファーストストランド合成キット（Invitrogen社）を用いて行きました。SYBRグリーン™ミックスI（Roche Diagnostics社）を増幅のために使用し、そしてサンプルを、ライトサイクラー-II™機器（Roche Diagnostics社）で行いました。[00249]動物研究。腫瘍原性研究のために100mlのPBSに懸濁した細胞は、年齢をマッチさせた免疫不全SCIDマウスの側腹部に皮下注射しました。マウスを屠殺し、6週間後に剖検しました。

[00250] A TPとROSアッセイ。細胞間のATPレベルは、ATPによって測定しました。

供給業者のプロトコルに従ってバイオルミネッセンスアッセイキットHS II™（ロシュ）。発光強度はGelomax™96マイクロプレートルミノメーター（Promega社、マディソン、WI）を​​用いて測定し、発光の読み取り値は、細胞数で標準化しました。ROSレベルの測定のために、細胞を培地中でインキュベートし、15分間、暗所で37℃で2μΜのジヒドロエチジウム（Molecular Probes）を含みます。次いで、細胞をPBSで洗浄し、0.5％BSAを含むPBS中に懸濁しました。30000細胞の蛍光強度は、BD Biosciences社LSR II（BD Bioscience社、スパーク、MD）を利用して記録しました。

[00251]キメラマウスの生成および解析 

[00252]二倍体と四倍体キメラの生産。二倍体胚をBDF1雄と交配BDF1株雌から得たICRのオスと四倍体胚と交配ICR系統の雌から得ました。四倍体胚は2細胞胚の電気融合により作製しました。トリプシン処理は、低キメラが発生したため、SACの球状コロニーを顕微鏡下でマイクロナイフを使用して小片に切断した本研究では、SACのの後、小さなクラスターは、大きなピペットで一日4.5胚盤胞に注入しました。次の日は、キメラ胚盤胞は一日2.5偽妊娠雌に移しました。

[00253]インビトロ分化アッセイで。 

[00254]中胚葉系譜分化アッセイ。ストレス改変された細胞塊は、その後、セルソーターによってのみのOct4-GFP陽性細胞を採取し、7日目に採取し、単一細胞に解離させました。回収した細胞は、DMEM、20％FCSを補充しました。培地は3日ごとに交換しました。7~14日後、筋細胞を抗平滑筋アクチン抗体（N1584、DAKO）で染色しました。陰性対照は、一次抗体は、特異性を保証するために、同一のアイソタイプのIgGを陰性対照と交換しました。

[00255]神経系統分化アッセイ。ストレス改変された細胞塊は、その後、セルソーターによってのみのOct4-GFP陽性細胞を採取し、7日目に採取し、単一細胞に解離させました。回収した細胞は、F12にオルニチンでコーティングしたチャンバースライド（ナルジェヌンクインターナショナル）上にプレーティングした/ DMEM（1：1、v / v）の2％B27（Invitrogen）を、10％FCS、ロング/ mlのbFGF（R＆Dシステムズ）と20ngを補充しました/メートルEGF（R＆Dシステムズ）。培地は3日ごとに交換しました。10-14日後、細胞を、4℃で30分間、4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで室温で15分間、0.2％トリトンX-100を含む洗浄し、PBSでブロックし、20分間、2％FCSを含有する培養します非特異反応、および抗βΙΙΙTubuinマウスモノクローナル抗体（G7121、Promega社）及び抗GFAPマウスモノクローナル抗体（AB5804、CHEMICON）と共にインキュベートしました。陰性対照は、一次抗体は、特異性を保証するために、同一のアイソタイプのIgGを陰性対照と交換しました。

[00256]肝分化アッセイ。ストレス改変された細胞塊は、その後、セルソーターによってのみのOct4-GFP陽性細胞を採取し、7日目に採取し、単一細胞に解離させました。回収した細胞は、500 mLの肝細胞基本培地（Lonza社、ヴッパータール、ドイツ）、0.5 mLのアスコルビン酸、10 mLBSA-FAF（遊離脂肪酸）、0.5から成る肝細胞培養培地中のチャンバー2ウェルスライドガラス（ナルジェヌンクインターナショナル）上にプレーティングしましたmLのヒドロコルチゾン、0.5 mLのトランスフェリン、0.5 mLのインスリン、0.5 mLのEGF、および0.5 mLのゲンタマイシン、アンホテリシン、10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Sigma）を補充した（GA-1000すべてのLonza社から）。

分化した細胞を、以下の抗体を用いimmunohistochemistoryによって検出しました。抗フェトプロテインマウスモノクローナル抗体（MAB1368、R＆Dシステム）と

抗サイトケラチン7マウスモノクローナル抗体（ab668、アビーム）。陰性対照は、一次抗体は、特異性を保証するために、同一のアイソタイプのIgGを陰性対照と交換しました。

【00257】インビボ分化アッセイ：ストレス改変された細胞塊は、7日で収集した後、セルソーターによってのみのOct4-GFP陽性細胞を採取し、単一細胞に解離させました。回収した細胞を、10％> FBSとDMEMの50μlの中に再懸濁しました。このソリューションは、ポリグリコール酸繊維、直径200ミクロンの不織布のメッシュで構成され、シート3×3×1ミリメートルに播種し、4週齢のNOD / SCIDマウスの背側脇腹に皮下移植しました。4週間後、インプラントを回収し、免疫組織化学的技術を用いて分析しました。インプラントは、パラフィンに包埋し、10％ホルムアルデヒドで固定し、そして日常的に厚い4-μιηに加工しました。切片をヘマトキシリン​​およびエオシンで染色しました。内胚葉組織は、内胚葉マーカーで同定されました

抗フェトプロテインマウスモノクローナル抗体（MAB1368、R＆Dシステム）。外胚葉組織を抗βΙΙΙチューブリンマウスモノクローナル抗体（G7121、Promega社）を用いて同定しました。

中胚葉組織を抗平滑筋アクチン抗体（N1584、DAKO）を用いて同定しました。陰性対照は、一次抗体は、特異性を保証するために、同一のアイソタイプのIgGを陰性対照と交換しました。

[00258] TCRfiチェーン組み換え分析。gDNAは、CD45陽性細胞由来のSACで生成されたキメラマウスからのSACと尾の先端から抽出しました。PCRを、以下のプライマーを使用して、50ngのgDNAを用いて行きました。

（5 '-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3'と 

5 '-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3'）増幅されたDNAを1.5％アガロースゲルで電気泳動しました。 

キメラマウスの[00259]ジェノタイピング。gDNAを4Nキメラマウスの尾の先端から抽出しました。遺伝子型決定は、以下のプライマーを用いて行きました。（GFP：

F-AGAACTGGGACCACTCCAGTGとR-TTCACCCTCTCCACTGACAGATCT。IL-2：F-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCTとR-GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC）

[00260]次いで、細胞を決定した発現したOct4を変更されたストレスを維持するための最適な培養条件を。ES確立培地、3I：を含む、いくつかの前述の培地¹⁶及びACTH ¹¹、ES培養条件、ES-LIF ¹⁸、

OCT4発現原始神経幹細胞培養条件、B27-LIF ¹⁹、及びEpiSCs文化

20 

条件は、試験しました。細胞を各培地に播種し、そしてGFP発現コロニーを計数した（図SIC）。メディアB27-LIFは球状コロニーをGFP発現を生成する際に最も効果的であると思われました。そこで我々は、処理した細胞の培養のためのB27-LIF培地を利用しました。

[00261]は、種々の組織から調達した細胞から生成したSACは異なる分化傾向を持っていたかどうかを調べるために、SACのは、フロリダ州のGFPマウス由来の様々な組織から生成されたICR胚盤胞にそれらを注入しました。次に、FACSを用いて、生成されたキメラマウスの各組織の寄与率を分析しました。これは、任意の組織由来のSACは、キメラマウス生成（データは示していない）に寄与することが見出されました。加えて、皮膚、脳、筋肉、脂肪、肝臓および肺への寄与率は、種々の組織由来のSACを使用して生成されたキメラマウスにおいて分析しました。任意の組織由来のSACは、3つすべての胚葉の組織の代表を生成するために貢献し、かついかなる分化傾向は（データは示さない）が観察されませんでした。

SACのからキメラマウスの表4世代 

キメラの号 

の号 

得られ 

細胞培養は、受精します 

高総胚のマウスの準備期間 

注射のSACのための株は、「いいえ子孫の寄与を注入しました 

BDF1クラスタ7日58 48 * 16 129B6F1クラスタ7日98 64 20 6 

GOFクラスタ7日73 35 24 2 

GOFクラスタ35 20 4 0 10日 

*すべての胎児が15.5 DPCに13.5 DPCで収集し、各器官へのSACの寄与率は、FACSで調べました 

**各キメラへのSACの寄与が高い（GFP発現の毛色の> 50％）として採点しました 

キメラマウスの生殖系列伝達を介してのSACからの子孫の表5の生産 

マウス株 

子孫のホスト番号との

ペアID。男性女性胚盤胞号総仔のGFPま​​たは黒い目（％）

第1高中ICR 9 5（56） 

第2ハイ非キメラICR 11 4（36） 

14 4 (29) 

第3中低ICR 9 0 

10 0 

13 0 

第4号中中ICR 4 2（50） 

10 6 (60) 

11 7 (64) 

いいえ。ファイブメディア媒体電球/ F 9 4（四〇から四）

5 3 (60) 

【実施例3 

[00262]理論に拘束されることを望まないが、本明細書に記載される方法は、アポトーシスに関連するプロセスを活性化するように意図さ、または細胞死を制御します。細胞への軽度の損傷は修復遺伝子の活性化を誘導することができます。細胞への深刻な損傷は、以前に未定義の生存メカニズムを活性化することができます。それが意図される細胞は、（応力が、本明細書中で細胞成分を記載されるような重大なストレスにさらされている場合、例えば

ミトコンドリア、小胞、核、リボソーム、小胞体、エキソソーム、エンドソーム、細胞膜、ミトコンドリア、リソソーム、ATP、タンパク質、酵素、炭水化物、脂質など）に損傷を受けた細胞から放出される「cellieu。」本明細書に記載のデータは、この「cellieu」が再構成および/または細胞の生存を促進することができることができることを示しています。さらに、ミトコンドリア（および他の細胞小器官）は、細胞の再構成を指示することができることを、理論に束縛されるものではないが、企図されます。そのため、小型、シンプルさ、細胞の分化を指示する能力、および原核生物のような性質のため、ミトコンドリアは、親細胞に致死的な証明ストレスを生き残ることができます。ミトコンドリアは、膜中に封入無細胞から放出され、および/または他の細胞成分に結合することができます。

[00263]また、理論に束縛されるものではないが、核は、いくつかのミトコンドリアを含むことができ、細胞膜中にカプセル化された、無傷のままであり得ます。非常に少ない細胞質と核のエピジェネティックな制御を失っている非常に少数の細胞小器官、これらの損傷を受けた細胞は、その後、相互作用し、おそらく押し出されてきた細胞小器官と融合することができます。これは、成長と複製に必要な細胞内の成分を細胞に提供するが、細胞は、エピジェネティックな制御を失っているため、より原始的な（例えば、より多能性）状態が誘導されます。

【実施例4：取得多能性を持つ再プログラムされた細胞中での胚と胎盤の系統のための発達の可能性 

本明細書において実証されるように[00264]一般に、生後体細胞の運命が決まっており、彼らは重要な転写と核移植1 '2または遺伝子操作を受けない限り、変更していないが、3因子、本発明者らは、体細胞の再プログラミングの予期しない現象を発見しました多能性の刺激trigged取得（STAP）と呼ばれる致死量以下の刺激による多能性細胞へ⁴。また、本明細書に記載STAP細胞はES細胞とは異なるユニークな分化能を示す再プログラム実証です。STAP細胞は、胚盤胞注入アッセイにおいて見られるように、胚の組織にも胎盤システムのみならず寄与することができます。胎盤の貢献のための彼らの有効性はさらにFGF4で培養して強化されました。逆に、本 ​​来限定自己再生能力を示したES細胞維持培地、STAP細胞におけるさらなる継代、栄養膜のような、ES細胞様示す強固に増殖する細胞株を作製はなく、特性に培養しました。これらの改変されたSTAP細胞（STAP幹細胞）が四倍体相補性アッセイでマウスを出産した⁵、もはや胎盤組織に寄与しません。このように、STAP細胞は、iPS細胞とは異なり、多能性の新規な準安定状態表すことができる⁶ ES細胞のものとは異なります。STAP細胞技術は、新世代の再生医療のための汎用性の高い、強力なリソースを提供することがあります幹。

本明細書中に記載[00265]は、携帯運命変換の興味深い現象である：体細胞は、このような低pHが暴露として亜致死刺激を経験した後に多能性を取り戻す⁴。脾臓CD45とき⁺（コミットT細胞を含む）の細胞は、30分間pH5.7にさらされ、LIFの存在下で、その後培養され、生存細胞のかなりの部分は、2日目（D2）での多能性のエルマーカーのOct3 / 4を発現して開始。D7によって、多能性細胞クラスターは、（奇形腫形成によって示されるように、例えば）3胚葉の分化のための善意の多能性マーカープロファイルと能力で形 ​​成します。これらSTAP細胞は、効率的にキメラマウスに寄与し、胚盤胞注入アッセイにおける生殖系列伝達を受けることができます。これらの特性は、ES細胞のものと似ているが、STAP細胞は、自己再生のために少なくとも、その限られた容量で、ES細胞とは異なるように思われる（典型的には、最大で3~5継代）および解離培養に対する脆弱性⁴。

[00266]本実施例では、本発明者らはさらに、独特の性質を調べました

STAP細胞における細胞の二つの主要なカテゴリにそれらの分化能力に焦点を当て 

7-9 

胚盤胞^"：内部細胞塊型（またはES細胞様）細胞および栄養膜/胎盤系列細胞胚盤胞注入アッセイは、予想外の知見を明らかにした後、一般的には、注入されたES細胞の子孫は、キメラの胚の部分で発見されています。しかし、まれに胎盤部分に⁷（データは示さず）。驚くべきことに、STAP細胞は胚にも胎盤および胚体外膜（図22）のみならず貢献注入した。この二系統の寄与はの約60％で観察されましたキメラ胚。

[00267]この知見は、STAP細胞の栄養膜分化能の調査を促しました。これは、栄養膜細胞株（トロホブラスト幹細胞ことが知られており、TS

8 9 

細胞）」FGF4の存在下で、胚盤胞の長期接着培養で誘導することができます。STAP細胞のクラスターが同じ条件（図23 A、96ウェルプレート中のウェルあたり1クラスタ）で培養した場合には、スフェロイドSTAP細胞クラスターは徐々に消失し、STAP細胞からの明確なフラットな外観を持つ細胞が出て成長し、によってコロニーを形成しましたD7-DL0（データは示さず）。OCT3 / 4 :: GFF発現の高いレベルを有するSTAP細胞とは異なり、これらの平らな細胞（プレート底部に付着した）は、FGF4での培養7日目に中程度のGFPシグナルを示した（データは示さず）。免疫染色は、FGF4誘発性（F4I）細胞が強く栄養膜マーカー発現したことが示された^{10 "12} OCT3 / 4の中程度のレベルに加えて、（データは示していない）インテグリンα7とEomesoderminを：：GFFのNanogの発現が検出可能であるが、非常に低かったです（データは示さず）。これと一致して、qPCR分析は、OCT3 / 4およびNanogの発現は、（親STAP細胞で見られるよりも低かったF4I細胞は、トロホブラスト系統マーカー遺伝子（例えば、CDX2）の実質的なレベルで発現することを示し図23B）、この確立と拡大は可能性がありますが。。（その非存在下では、彼らは増殖を停止した）これらのF4I細胞は二日おきにトリプシン消化で継代することにより効率的に拡張することができると彼らはFGF4の存在下で、30以上の継代のために安定的に推移MEF細胞上およびゼラチンコート底に両方行う、MEFフィーダー上で培養したものがより明確上皮の外観を（データは示されていない）を示す傾向がありました。

[00268]胚盤胞注入アッセイにおいて、F4I細胞の胎盤寄与はしばしば（データは示していない）（50〜60％）が観察されました。キメラ胎盤では、F4I細胞は、典型的には、全胎盤細胞の10％に貢献した（図23C、レーン1-3;そのコントロールに注意してES細胞は、レーン4-6を実質的胎盤貢献を与えませんでした）。これらの知見は、STAP細胞は、少なくともトロホブラストのマーカー発現および胎盤の寄与の観点から、FGF4処理によってTS様細胞を生成する能力を有することを示唆しています。TS様細胞への誘導のこのタイプは、ES細胞（遺伝的に操作されていない限り）と共通ではないので¹¹、このような能力は、ES細胞とは異なるSTAP細胞の別の特徴を表すことができます。

【00269】一方、STAP細胞由来F4I細胞はまた、異なる所有することができます 

胚盤胞由来TS細胞からの13の特徴。まず、従来のTS細胞とは異なり、F4I細胞は、OCT3 / 4の適度なレベルを発現した（データは示さず）。寄与の程度は（データは示されていない）は、一般的に低かったが、また、TS細胞とは異なり、胚盤胞注入F4I細胞はまた、（キメラ胎盤に関連するすべての場合に）、胚性部分に寄与しました。

[00270]まとめると、これらの観​​察は、STAP細胞集団は、胎盤の分化のために彼らの能力に関して、ES細胞から質的に異なっていることを示しています。 

これを考慮して、[00271]は、胚系統への分化は、胚盤胞に存在する他の細胞型を調べました。ES細胞とは異なり、STAP細胞は限られた自己再生能を有し、単一の細胞から展開することができません。STAP細胞は、（STAP細胞樹立で使用B27 + LIF培地を含む）は、従来のLIF含有培地中で（でもクラスタの部分的な解離文化と）以上5継代にわたって維持することができませんでした。しかし、LIFとACTH含有培地¹⁵（ACTH媒体、以下）がSTAP細胞コロニーの成長速度の比較的良好な支持効果を有していた（データは示さず）。ときACTH培地中のMEFフィーダー又はゼラチン（図24 A）で、この培地中で培養し、96ウェルプレートを使用して、単一のクラスタ・文化のウェルのSTAP細胞クラスター（一般的に20から50パーセントに見られる））の一部が成長を続け（データは示さず）。これらの成長するコロニーは、マウスES細胞に類似しており、OCT3 / 4の高レベルを発現しました：。GFP。親STAP細胞とは異なり、これらの拡張のコロニー中の細胞は、7日間、この培地中で培養した後、分解に対して耐性となり、単一細胞として継代することができた（データは示さず）。STAP細胞とは対照的に、これらの改変された細胞は、ES細胞のような培養物の少なくとも120日（図24B）まで、指数関数的に拡張することができます。マルチカラーFISH分析によって示されるように、この強化された拡張は、染色体異常を伴わなかった¹⁶（データは示さず）。7日間の増殖後、細胞は増殖し、この最初の7日間の拡大が最も効率的にACTHを用いて行ったが、試験されたES細胞培地のいずれかで維持することができ

17 

媒体（例えば、コロニーをゆっくりと少ない頻度3I媒体内に形成され、データは示さず）。 

【00272】以下、STAP細胞由来増殖細胞はと呼ばれています

STAP幹細胞。STAP細胞とは異なり、STAP幹細胞はFGF4と培養においてTS様細胞を生じなかった（データは示さず）。免疫染色を介して、それが雌STAP細胞（REF）のかなりの割合で発見されたX染色体不活性化18は、もはやSTAP幹細胞では観察されなかったことが判明した（データは示さず）。STAP幹細胞は、ES細胞のための種々のRA（図24C）お ​​よびタンパク質（データは示していない）のマーカーを発現しました。CD45からの転換により脱メチル化になるOCT3 / 4およびNanog遺伝子座におけるDNAメチル化レベル、⁺細胞をSTAPするには、低い（図24D）を残りました。分化培養で^{19 "21}、STAP幹細胞（データは示していない）、外胚葉、中胚葉および内胚葉誘導体を生成した。これらの知見は、STAP幹細胞の展示がES細胞のものと区別できない備えていることを実証します。

[00273]これと一致して、STAP幹細胞は、さらに、複数の継代の後、奇形腫を形成する（データは示していない）と、胚盤胞の注入によって、効率的に（データは示していない）キメラマウスに寄与し得ます。その胚の寄与がSTAP幹細胞の顕著な有効性を明示的に四倍体の相補アッセイであるという事実によって証明された⁵、これらの細胞は大人に成長しても子孫を生成することができるマウスを産むことができた（データは示さず）。（そのような完全な相補性があっても一般的に使用されるES細胞株でしばしば困難であることに注意してください）STAP幹細胞の8つの独立したラインが再現可能にこの能力を示したことを考えると、我々は、成体の体細胞に由来するSTAP細胞は、ための魅力的な供給源であり得ることが推測します（または多分スーペリア）に相当する多能性幹細胞株の誘導は、この態様で自分自身を胚盤胞。

彼らはキメラ（図25A-25B）での様々な組織をもたらしたのに対し[00274]は、重要なことは、STAPとF4I細胞とは異なり、STAP幹細胞は、（データは示していない）胎盤組織に貢献する能力を失っているように見えます。したがって、STAP細胞とSTAP幹細胞との間の差は、単に自己再生活動に限定されるものではなく、胎盤の系統に分化する能力の喪失を伴います。

[00275]これらの知見は、STAP細胞のユニークな多能性状態を示しています。単一細胞（上記）からSTAP細胞のクローンを作成することができないことは、単一細胞レベルでのコミットメント分析を妨げるが、それはSTAP手順は、胚と胎盤の両方の系統のための能力を持つ多能性細胞集団の中に体細胞を変換できることは注目に値します。STAP細胞の分化状態の深い理解は、将来の研究のための重要なトピックです。特に、桑実胚期に胚細胞に似ている胎盤系統のためのそれらの能力によって示唆されるようにSTAP細胞は、ES細胞よりも未成熟な状態を表しているかどうかを調べるのは興味深いだろう。最近の研究では、従来のES細胞培養ものOct3 / 4の非常にマイナーな人口含まれていることを報告した^」との細胞を

22 

明確なキャラクターは非常に初期段階の胚の機能に似ています。STAP細胞はES細胞とは異なり、これは、細胞集団の大部分において見出される、二重能力の能力を可能にする同様の準安定状態を有していてもよいが。

[00276] STAP細胞がへの変換のための能力を持っていることを、本明細書に示されています

ES様多能性幹細胞株。（雌マウスから）STAP細胞は、X染色体不活性化に多少のモザイクであることは注目に値します。不活性化は、STAP細胞の-40％で消失⁴残りはそれを維持しながら、。ES細胞においては、対照的に、両方のX染色体を再現活性化されます。興味深いことに、導出した後、STAP「幹」細胞が無表示します

親STAP細胞におけるエピジェネティックな制御は、この意味では、類似しているが、マウスES細胞と同一ではないことを示唆しているES細胞のようなX染色体不活性化、。 

【00277】本結果は、致死量以下の刺激に曝露されるとナイーブ細胞に自分の運命を再プログラムすることを約束した体細胞の予期せぬ「自発的な変換能力」を実証します。これは、上記のものを含む多数の興味をそそると深遠な生物学的問題を提起します。それらの上には、この新たに発見されたSTAP現象は、幹細胞医学の方法論に革命をもたらすことができます。組織の様々な種類の生成が（癌性形質転換のリスクを増加させることができる）遺伝子導入せずに体細胞から誘導されたSTAP細胞、またはSTAP幹細胞から分化操縦によって許可され得ることが企図されます。また、iPS細胞の変換とは異なり、STAP変換はこのような低pHの暴露のような強い刺激によってトリガーされる特定の内因性のプログラムによって非常に高い周波数と進行で起こります。STAP幹細胞ので、ES細胞のように、彼らは厳格な品質管理の下、医学的に有用な組織の大規模生成のためのSTAP細胞よりも適しているであろう、容易に拡張およびクローン可能です。我々の予備的研究において、本発明は、網膜前駆細胞の皮質前駆細胞及び拍動心筋細胞（データは示していない）にSTAP幹細胞の効率的な分化を実証することに成功しました。

[00278]方法 

[00279]細胞培養。STAP細胞は、CD45から生成された⁺ B27 + LIF培地で培養し、低pH溶液への過渡的な曝露によって細胞（小保方ら、2013;共同提出します）。F4I細胞株の確立のために、STAP細胞クラスターはに移しました

96ウェルプレート中でMEFフィーダー細胞上FGF4含有TS培地。細胞は、従来のトリプシン法を用いて、D7-DL0の間に第1の通路に供しました。STAPステム（STAPS）細胞株の樹立のために、STAP球は、MEFフィーダーまたはゼラチンコートディッシュにACTH含有培地に移しました。4~7日後、細胞をトリプシン従来の方法を使用して第1の通路に供し、懸濁細胞を、5％FCS及び1％KSR含有培地を維持ESに播種しました。

[00280]キメラマウスの生成と分析。STAP幹細胞、F4I細胞とES細胞の注入のために、従来の胚盤胞注入法を用いました。トリプシン処理は、低キメラ現象が発生したためSTAP細胞の注射のために、STAP細胞クラスターは、一括して注入しました。STAP球状コロニーを顕微鏡下でマイクロナイフを使用して小片に切断した後、STAPコロニーの小さなクラスターは、大きなピペットで一日4.5胚盤胞に注入しました。次の日は、キメラ胚盤胞は、一日-2.5偽妊娠の雌に移しました。四倍体胚は2細胞胚の電気融合により作製しました。

[00281] in vitroおよびin vivo分化アッセイで：テラトーマ形成は注入ルクスで調べたLO ⁵皮下に4週齢のNOD / SCIDマウスの背側脇腹にSTAPS細胞の細胞。インビトロで神経分化にSDIAとSFEBq方法によって誘導された24 '26インビトロendomesodermal分化25は、成長因子（アクチビン）または10％FCSをSTAPS細胞凝集体を培養することによって誘導しました。

[00282]核型分析。サブコンフルエントSTAPS細胞は、コルセミドにより中期で逮捕され、多色FISH分析（M-FISH）に供しました。マウス染色体特異塗装プローブはコンビナトリアル7つの異なる蛍光色素を用いて標識し、以前に記載（Jentschら、2003）のようにハイブリダイズさせました。

[00283]細胞培養。STAP細胞は、CD45から生成された⁺説明したように、7日間B27 + LIF培地で培養し、細胞（小保方ら、2013;共同提出します）。F4I細胞株の確立のために、STAP細胞クラスターは、96ウェルプレート中でMEFフィーダー細胞上FGF4含有TS培地に移しました。細胞は、従来のトリプシン法を用いて、D7-DL0の間に第1の通路に供しました。その後の継代3日ごとに行われました。[00284] STAPステムについて（STAPS）細胞株の確立、STAP球は、MEFフィーダー細胞上ACTH含有培地に移しました。4~7日後、細胞をトリプシン従来の方法を使用して第1の通路に供し、懸濁細胞を、5％FCS及び1％KSR含有培地を維持ESに播種しました。その後の継代は、一日おきに行きました。

[00285]キメラマウスの生成と分析。二倍体と四倍体キメラの生産のために、二倍体胚をICR系雌から入手したICR系雄と交配し、四倍体胚をBDF1の雄と交配BDF1系統の雌から得ました。四倍体胚は2細胞胚の電気融合により作製しました。STAP幹細胞、F4I細胞とES細胞の注入のために、従来の胚盤胞注入法を用いました。STAP幹細胞、F4I細胞とES細胞の注入のために、従来の胚盤胞注入法を用いました。トリプシン処理は、低キメラ現象が発生したためSTAP細胞の注射のために、STAP細胞クラスターは、一括して注入しました。STAP球状コロニーを顕微鏡下でマイクロナイフを使用して小片に切断した後、STAPコロニーの小さなクラスターは、大きなピペットで一日4.5胚盤胞に注入しました。次の日は、キメラ胚盤胞は、一日-2.5偽妊娠の雌に移しました。

[00286] in vitroおよびin vivo分化アッセイで：LX LO ³ STAP-Sの細胞の細胞は4週齢のNOD / SCIDマウスの背側脇腹に皮下注射しました。6週間後、移植片を回収し、組織学的に分析しました。インプラントは、パラフィンに包埋し、10％ホルムアルデヒドで固定し、そして日常的に厚い4-μιηに加工しました。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました。

【00287】インビトロ神経分化は、SDIAとSFEBq方法によって誘導されました。インビトロendomesodermal分化における増殖因子（アクチビン）または10％FCSをSTAPS細胞凝集体を培養することによって誘導しました。

[00288]免疫染色。細胞を、15分間、4％PFAで固定し、0.5％トリトンX-100で透過処理した後、次いで、一次抗体と共にインキュベートした：抗H3K27me3（Millipore社; 1：300）、抗のOct3 / 4（サンタクルーズバイオテクノロジー; 1： 300）、抗Nanogの（eBioscience社; 1：300）、抗KLF2 / 4（R＆Dシステム; 1：300）、および抗Esrr（R＆Dシステム。

1：300）。一晩インキュベートした後、境界抗体がAlexa546とコンジュゲート二次抗体（Molecular Probes）で可視化しました。核はDAPIで染色しました

（Molecular Probes社）。 

[00289] RNA調製andRT-PCR分析。RNAをRNeasy™を用いて単離しました

ミニキット（QIAGEN）。逆転写はSupeSACript IIIファーストストランド合成キット（Invitrogen社）を用いて行きました。パワーSYBRグリーン™ミックス（Roche Diagnostics社）をPCR増幅に使用し、そしてサンプルを、ライトサイクラー-II™機器（Roche Diagnostics社）で行いました。

[00290]核型分析。核型分析は、多色FISH分析（M-FISH）により行いました。サブコンフルエントSTAPS細胞を、5％CO 2中、37℃で2.5時間、培地にコルセミド（最終濃度0.270 / mlの）によって中期で停止しました。細胞を細胞培地中に再懸濁し、1200rpmで5分間遠心分離し、トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で処理し、PBSで洗浄しました。PBS 3mlの、予熱低張0.0375 M KC 1溶液7mlに細胞ペレットに添加しました。細胞を37℃で20分間インキュベートしました。細胞を、1200rpmで5分間遠心分離し、ペレットを0.0375 MのKCl溶液を3-5 ml中に再懸濁しました。穏やかにピペッティングし;細胞をメタノール/酢酸（容量/容量1 3）で固定しました。固定前のガラススライド上の細胞の拡散を4回行いました。FISHの手順については、マウスの染色体特異的絵画プローブは、コンビナトリアル7つの異なる蛍光色素を用いて標識し、以前に（Jentschら、2003）記載されているようにハイブリダイズさせました。各細胞株については、9-15中期スプレッドはSENSYS CCDカメラ（Photometries、ツーソン、アリゾナ州）を装備したLeica DM RXA RF8エピ蛍光顕微鏡（ライカMikrosysteme社、ベンスハイム、ドイツ）を使用して取得しました。カメラと顕微鏡はライカQ-FISHソフトウェア（ライカマイクロシステムズぶら下がっソリューション、ケンブリッジ、英国）によって制御されていました。中期スプレッドは、ライカMCKソフトウェアに基づいて処理され、多色karyogramsとして提示しました。

[00291]バイサルファイトシーケンス。 

[00292]ゲノムDNAをSTAPS細胞から抽出しました。DNAの重亜硫酸塩処理は、製造業者の説明書に従ってCpGenome DNA修飾キット（ケミコン、テメキュラ、CA、http://www.chemicon.com）を用いて行きました。

[00293] DNAは、2つの順方向（F）プライマーと一つの逆を使用して、ネストされたポリメラーゼ連鎖反応PCRによって増幅した修飾され得（R）プライマー：OCT3 / 4（FL、GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT（SEQ ID NO： 

73）; F2、ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA（SEQ ID NO： 

74）; R、CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC（SEQ ID NO：75））。およびNanog

（F1、GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT（SEQ ID NO：76）; 

F2、AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT（SEQ ID NO：77）; 

R、CCCACACTCATATCAATATAATAAC（SEQ ID NO：78））。PCRは、タカラ例のTaqホットスタートのバージョン（RR030A）を用いて行きました。DNA配列決定は、ゲノム資源解析ユニット、理研CDBでM13プライマーを用いて行きました。94]参照

ガードン、JB。送りオタマジャクシの腸上皮細胞から採取した核の発達能力。J Embryol経験モルフォリン。10、622から640（1962）

和歌山、T.、ペリー、A. C、Zuccotti、M.、ジョンソン、KR＆柳町、卵丘細胞核を注入し除核卵母細胞からマウスのR.フル長期的な開発。自然394、369-374（1998）。

高橋、K.＆山中、マウスの胚性と定義された因子による大人の線維芽細胞培養物からの多能性幹細胞のS.誘導。セル126、663から676（2006）。

小保方ら、多能性への体細胞の刺激・トリガフェイト変換。この原稿に共同提出しました。

ナジ、A.、Rossant、J.、ナジ、R.、Abramow-Newerly、W.＆Roderの、早期継代胚性幹細胞から完全に細胞培養由来のマウスのJCの導出。PROC国家科学アカデミー物理研サイエンスUSA 90、8424から8428（1993）。

大串、M.と笹井、ヒト多能性幹細胞のY.ロンリー死の踊り：準安定セル状態との間でロッキング。細胞生物学21年の傾向、274から282（2011）。

丹羽、H.はどのように多能性を決定し、維持されていますか？開発134、635から646（2007）

クインJ、Kunath T、Rossant J.マウストロホブラスト幹細胞。メソッドモルメッド。121、125から148（2006）。

Rossant J.は、哺乳動物の胚盤胞に細胞および系統の開発を幹。Reprod FERTILのDev。19、111-8（2007）

田中TS、Kunath T、キンバーWL、Jaradat SA、スタッグCA、臼田M、横田T、丹羽H、Rossant J、コMS。胚由来の幹細胞の遺伝子発現プロファイリングは、多能性および系統特異性に関連した候補遺伝子を明らかにする。ゲノムRes.12、1921年から1928年（2002年）

Klaffky E、ウィリアムズR、八尾CC、Ziober B、クレイマーR、ペリ注入マウス胚におけるインテグリンα7サブユニットのサザーランドA.栄養膜特異的な発現および機能。デベロッパーBIOL。239、161から175（2001）。

ラスAP、Wattler S、CoUedge WH、AparicioのSA、カールトンMB、ピアースJJ、バートンSC、Surani MA、ライアン・K、Nehls MC、ウィルソンV、エヴァンスMJ。Eomesoderminは、マウス栄養膜の開発と中胚葉形成のために必要とされます。自然404、95-99（2000）。

丹羽H、豊岡Y、Shimosato D、Strumpf D、高橋K、八木R、のOct3 / 4とCdx2の間Rossant J.の相互作用は、栄養外胚葉分化を決定します。電池123、917から929（2005）豊岡Y、Shimosato D、村上K、高橋K、丹羽H.同定および未分化ES細胞培養における亜集団のキャラクタリゼーション。開発135、909から918（2008）。

小川、K.、松井、H.、大塚、S.＆丹羽、H.マウスES細胞のクローン増殖を調節するための新規メカニズム。セル9個の遺伝子、471から477（2004）。

Jentsch I、Geigl J、クラインCA、スペイサーMR。染色体間再配列の高分解能分析のためのセブン - 蛍光色素マウスM-FISH。CytogenetゲノムRES。103、84-88（2003）、

英、QLら。胚性幹細胞の自己再生の基底状態。自然453、519から523（2008）。

村上K、荒木K、大塚S、和歌山T、女性の胚性幹細胞由来の胚体外細胞内でランダムではなく、インプリントされたX不活性化の丹羽H.選択。開発138、197-202（201 1）。

Watanabe, K., Kamiya, D., Nishiyama, A., Katayama, T., Nozaki, S., Kawasaki, H., Mizuseki, K., Watanabe, Y., and Sasai, Y. (2005) Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neurosci. 8, 288-296 

Kawasaki, H., Mizuseki, K. , Nishikawa, S., Kaneko, S., Kuwana, Y., Nakanishi, S., Nishikawa, S.-I. and Sasai, Y. (2000) Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by Stromal Cell-Derived Inducing Activity. Neuron 28, 31-40. 

Gouon-エバンスV、Boussemart L、Gadue P、Nierhoff D、ケーラーCI、久保A、Shafritz DA、ケラーG.（2006）BMPは-4マウス胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の肝臓の仕様のために必要とされます。ナットBiotechnol。24、1402から141まで1。

Macfarlan TS、ギフォードWD、ドリスコルS、Lettieri K、ロウHM、Bonanomi D、ファースA、歌手O、Trono D、パーフSL。胚性幹細胞の効力は、内在性レトロウイルス活性と変動します。自然487、57-63（2012）。

Eiraku, M., Takata, N., Ishibashi, FL, Kawada, M., Sakakura, E., Okuda, S., Sekiguchi, K., Adachi, T. and Sasai, Y. (201 1) Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature 472, 51-56. 

Eiraku, M, Watanabe, K., Matsuo-Takasaki, M., Kawada, M., Yonemura, S., Matsumura, M., Wataya, T., Nishiyama, A., Muguruma, K. and Sasai, Y. (2008) Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ES cells and its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell 3, 519-532 

Boheler KR、チジュJ、トゥイーディーD、ヤンHT、アニシモフSV、Wobus AM。心筋細胞への多能性胚性幹細胞の分化。CIRC Res.9 \、189-201（2002）。26.川崎、H.、Mizuseki、K.、西川、S.、金子、S.、桑名、Y.、中西、S.、西川、S.-I. そして、笹井、間質細胞由来誘導活性によりES細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンのY.誘導。ニューロン28、31-40（2000）

表6：STAPから多能性細胞株の樹立 

多能性試験（キメラ形成）

中古井戸のマウス系統番号*。第樹立細胞株（％）

C57BL / 6（GOF）29 29（100）はい129B6F1（GFP）16 12（75）はい129 / SV（GFP）2 2（100）はい

* STAPの各ウェルに含まれる1-4個 

表7：四倍体相補法によるFLS細胞株からのSTAPSマウスの作製 

生殖ラインの号のキメラ号の号

生き残った成人期伝送の細胞株名の胚カルスマウス号

FLS-1 7 7 31 4はい

FLS-2 3 2 29 2はい

FLS-3 46 8 8 4はい

FLS-4 9 46 2 8はい

FLS-5 21 10 5 9はい

FLS-6 12 4 4 4はい

FLS-7 6 21 3 3はい

FLS-8 22 2 5 2はい

小計228 52（22.8）43（82.7）26（60.5） 

続き-1 8 5 4はい

続き-2 21 5 5 4はい

アカウント-3 21 3 1 0 - 

小計50 13（26.0）11（84.6）8（72.7） 

子孫を混合し、原因養母の表8の十分な数の不足のために、同じ母に育て：二倍体胚を用いたFLS細胞株からのキメラマウスの作製 

キメラ生殖ラインの号の号

キメラの細胞株号 

子孫伝達名の胚合計非常に高い高い低いです 

FLS-1 16 7 6 1 2 3はい

FLS-2 17 13 9 2 2 5はい

FLS-3 32 16 12 6 4 2はい

FLS-4 20 5 4 1 2 1はい

FLS-21 5 5 4 0 3 1はい

FLS-6 21 13 7 1 3 3はい

FLS-7 32 14 5 11 1はい

FLS-8 32 12 8 3 2 3はい

小計191 84 62（73.8） 

続き-1 16 9 9 6 2 1はい

続き-2 18 12 8 3 2 3はい

続き-3 18 11 4 0 1 3はい

小計52 32 21（65.6） 

表9：セル特性